不同飼養(yǎng)層對牛胚胎干細胞培養(yǎng)效果的影響.pdf

1、雖然圍繞牛胚胎干細胞建系已進行了大量的研究，但迄今為止仍未建立適合牛胚胎干細胞的環(huán)境條件。探索一種適合其生長的飼養(yǎng)層保持未分化狀態(tài)，對保證干細胞的全能性具有重要意義。本實驗采用兩種不同飼養(yǎng)層培養(yǎng)的牛胚胎干細胞，采用形態(tài)學鑒定、免疫熒光染色、堿性磷酸酶染色、擬胚體形成OCT4、SOX2、NANOG的RT-PCR檢測等方法對牛胚胎干細胞進行檢測；進一步通過實時熒光定量方法檢測以小鼠胎兒成纖維細胞作為飼養(yǎng)層培養(yǎng)的不同代次牛胚胎干細胞標志基因O

2、CT4、SOX2、NANOG表達差異，并與兩種飼養(yǎng)層培養(yǎng)的同一代次牛胚胎干細胞多潛能特征基因OCT4、SOX2、NANOG的表達量進行了比較，以求探索一種新的更適合牛胚胎干細胞生長的飼養(yǎng)層，為最終建立牛胚胎干細胞系提供實驗依據(jù)。
　　 1.首次采用以小鼠胎兒成纖維細胞和同源的牛胎兒成纖維細胞按一定比例(5種)制成的混合飼養(yǎng)層培養(yǎng)牛胚胎干細胞。結果顯示生長在混合飼養(yǎng)層上的牛胚胎干細胞比單獨生長在小鼠或牛胎兒成纖維細胞飼養(yǎng)層的結構致

3、密、與滋養(yǎng)層界限明顯；小鼠和牛胎兒成纖維細胞在1:1比例混合飼養(yǎng)層培養(yǎng)條件下牛胚胎干細胞克隆結構致密、顯著堆積且邊緣輪廓清晰，優(yōu)于其它比例組合；獲得的牛胚胎干細胞AKP染色及OCT-4、SSEA-1抗原表達均成陽性，分別在體外分化培養(yǎng)形成了擬胚體。結果表明小鼠和牛胎兒成纖維細胞在以1:1比例混合下制成的飼養(yǎng)層能更好的支持牛胚胎干細胞的體外生長，得到的克隆形態(tài)最好。
　　 2.采用國產(chǎn)絲裂霉素處理不同濃度的SIM小鼠成纖維細胞耐硫

4、代鳥嘌呤和耐鳥苯苷亞系(STO細胞)作為飼養(yǎng)層培養(yǎng)牛胚胎干細胞，為牛胚胎干細胞培養(yǎng)體系的建立提供實驗依據(jù)。用10、15、20、30、40μg/mL國產(chǎn)絲裂霉素分別處理1.5、3、4h的STO細胞，隨著傳代次數(shù)的增加形態(tài)學觀察STO細胞生長變化，并對生長在以STO細胞作為飼養(yǎng)層的牛胚胎干細胞進行OCT-4和SSEA-4免疫組化檢測、堿性磷酸酶染色、體外分化形成擬胚體等實驗。結果顯示當絲裂霉素的濃度為15μg/mL處理3h可有效的抑制細胞分

5、裂；STO細胞在5-10代作為飼養(yǎng)層細胞形態(tài)最好且獲得的牛胚胎干細胞AKP染色及OCT4、SSEA-4抗原表達均成陽性，且在體外培養(yǎng)可形成擬胚體。結果證明使用國產(chǎn)絲裂霉素能有效的處理STO細胞且在以STO細胞作為飼養(yǎng)層培養(yǎng)的牛胚胎干細胞能很好的保持其未分化狀態(tài)。
　　 3.檢測牛胚胎干細胞的多潛能特征基因-OCT-4、SOX2、NANOG表達情況，以此找到影響牛胚胎干細胞生長的主要原因。通過RT-qPCR檢測以MEF為飼養(yǎng)層生長

6、的第1代到第5代牛胚胎干細胞多潛能特征基因和相關因子表達差異，結果發(fā)現(xiàn)生長在以MEF作為飼養(yǎng)層上的牛胚胎干細胞隨著傳代的增加OCT-4、SOX2、NANOG三者表達量明顯減少，導致牛胚胎干細胞自身維持多能性能力降低且促進相關分化基因的表達，這是以MEF作為飼養(yǎng)層培牛胚胎干細胞無法持續(xù)傳代的根本原因。以兩種新的飼養(yǎng)層即牛和小鼠胎兒成纖維混合飼養(yǎng)層和STO細胞培養(yǎng)的第五代牛胚胎干細胞進行RT-qPCR檢測多潛能特征基因和相關因子表達。結果表