EGFP標記胚胎干細胞體外向心肌樣細胞分化及擬胚體形成的初步研究.pdf

1、本研究用磷酸鈣共沉淀法將質(zhì)粒pEGFP—N2導入小鼠胚胎干細胞D3細胞系中,在熒光顯微鏡下以488nm激發(fā)光檢查陽性克隆,并進行初步擴增.經(jīng)G418篩選后,機械挑取EGFP強陽性表達的克隆,并在絲裂霉素C處理的小鼠胚胎成纖維細胞的飼養(yǎng)層上進一步擴大培養(yǎng),獲得純化的轉(zhuǎn)染細胞系.20代以后,轉(zhuǎn)染細胞仍然表達綠色熒光蛋白.PCR檢測和序列分析表明8代和18代轉(zhuǎn)染細胞均攜帶有GFP標志基因.對穩(wěn)定表達EGFP的干細胞系進行堿性磷酸酶染色、擬胚體

2、和畸胎瘤形成的檢測,證明這些細胞具有干細胞的特征.經(jīng)擬胚體,可進一步分化成具有搏動能力的心肌細胞,分化百分率為30-40﹪,較未轉(zhuǎn)染細胞60-70﹪的分化率低.這些細胞在激光共聚焦顯微鏡下呈綠色熒光,免疫組化染色顯示具心肌細胞特異的cTnT分子標志.該EGFP標記的干細胞系帶有可進行原位、實時檢測的綠色熒光,可應(yīng)用于細胞移植和體內(nèi)分化的研究.胚胎干細胞在添加分化抑制物胚胎成纖維細胞或LIF等適宜的培養(yǎng)條件下,在體外長期能夠一直增殖保持未

3、分化狀態(tài)和全能性,撤除分化抑制物則進入分化狀態(tài),在體外懸浮培養(yǎng)時,胚胎干細胞形成三維聚集體一擬胚體(embryoidbodies,EBs).EBs是來自一個或多個能夠形成或具有潛能形成來自三胚層細胞的多能干細胞的分化細胞聚集體.盡管EBs在ESC分化的過程中扮演著重要角色,但對于EBs形成方法和形態(tài)上的研究資料仍然很少.本研究除了使用傳統(tǒng)的懸滴法以外,建立了STO法等其他方法獲得EBs,以心肌樣細胞發(fā)育作為模式系統(tǒng)比較細胞增殖和分化,以

4、ESC是否形成搏動心肌細胞檢測在不同分化培養(yǎng)體系中比較正常EB的形成.結(jié)果表明以所建立的STO法、懸浮法、膠原酶法與傳統(tǒng)的懸滴法相比,均可以得到不同比例的出現(xiàn)搏動心肌的EBs,統(tǒng)計結(jié)果顯示只有STO法得到的EBs數(shù)與懸滴法相比無顯著性差異,p>0.05;而懸浮法和膠原酶得到的EBs數(shù)低于懸滴法,具有顯著性差異(p<0.05).形態(tài)研究表明,所得到的EBs經(jīng)過了簡單擬胚體(sEB)發(fā)育為囊狀擬胚體(cEB)或成熟擬胚體(mEB),EBs細