α-7亞型乙酰膽堿能受體對于大鼠心肌微血管內(nèi)皮細胞在高糖損傷下的保護作用及其機制.pdf

1、背景：
　　截止到2012年，英、美、中國以及阿拉伯地區(qū)國家的糖尿?。―iabetes mellitus，DM）的患病率已分別高達8％、11.5%、16%與18%。中國糖尿病患病率逐年升高，全國已有超過9250萬人患有糖尿病，此外尚有約1.51億人正處于糖尿病前期。目前糖尿病心血管并發(fā)癥是糖尿病患者的“第一殺手”，74%-81%的糖尿病患者均死于突發(fā)的心血管意外事件。隨著對動脈粥樣硬化（AS）發(fā)病機制的深入研究以及血管再通治療的更

2、為廣泛的開展，糖尿病導致的冠狀動脈大血管病變的治療已取得了階段性進展,然而，糖尿病導致心肌微血管損傷的機制卻仍不明確。目前國內(nèi)外對糖尿病心臟損害的治療策略，主要包括控制血糖、調(diào)節(jié)能量代謝、及應用鈣通道阻滯劑等，但遺憾的是，糖尿病患者心血管意外事件的發(fā)生率以及死亡率仍居高不下，防治任務(wù)仍十分艱巨。
　　影響心血管意外發(fā)生及其死亡率的一個重要因素就是心肌微循環(huán)水平，其直接影響心肌灌注并決定冠脈儲備，對于維持心肌細胞正常的生理功能至關(guān)重

3、要，2007年N Engl J Med的文章曾指出，糖尿病心肌微循環(huán)障礙與糖尿病患者心臟病的預后密切相關(guān)；并預測，糖尿病心肌微血管可能是糖尿病心臟病變重要的治療靶點。然而，到目前為止，糖尿病心肌微血管損傷的機理仍不清楚。
　　最新研究顯示糖尿病心肌損傷與心肌組織局部慢性炎癥密切相關(guān)，但心肌組織中的炎性因子卻并非心肌細胞所分泌。在國家自然科學基金（No.81070126，No.81300078）的資助下，我室對糖尿病心肌的損傷及機制

4、進行了初步探討，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：糖尿病狀態(tài)下，心肌微血管密度下降，屏障功能破壞，心肌微血管內(nèi)皮細胞（CMEC）產(chǎn)生大量ROS與TNF-α、IL-1β、IL-2等炎癥因子，誘發(fā)局部炎癥反應（Inflamm Res.2011；PLoS ONE.2012；Basic Res Cardiol.2014），但介導血管新生的能力卻下降（Microvasc Res.2010；Apoptosis.2010）。那么，糖尿病心肌微血管內(nèi)皮細胞同時出現(xiàn)局部炎癥反應

5、增強和血管新生能力下降的現(xiàn)象，是否只是巧合？或是背后存在關(guān)聯(lián)？目前尚不明確。
　　研究顯示，α7亞型尼古丁乙酰膽堿能受體（α7nAChR）是膽堿能抗炎通路上的關(guān)鍵效應分子（Nature，2003），干擾其生成或者敲除后，不管是電刺激還是應用α7nAChR激動劑都無法抑制TNFα等炎癥因子的釋放。筆者所在實驗室在國際上率先發(fā)現(xiàn)尼古丁乙酰膽堿能受體（nAChRs）可以通過調(diào)節(jié)干細胞生物學活性刺激心肌血管新生（Plos one,2009

6、）。其他研究顯示，在nAChRs家族中，介導血管新生的正是其中的α7亞型-即α7nAChR(J Cell Biochem,2009)。同時，筆者所在實驗室還發(fā)現(xiàn)，鑒于α7nAChR在介導血管新生中的重要作用，其靶向分子成像有望用于疾病早期血管新生的早期無創(chuàng)診斷（國科金 No.81000141）。既然α7nAChR在抗炎通路與血管新生通路上都發(fā)揮如此重要的作用，那么它在糖尿病心臟組織損傷中的作用如何呢？2012年2月4日，我們以α7nAC

7、hR、diabetes、heart為關(guān)鍵詞在pubmed上進行文獻檢索時發(fā)現(xiàn)，檢索結(jié)果為零，這一在抗炎和促血管新生中具有重要作用的乙酰膽堿能受體在糖尿病心臟組織損害領(lǐng)域內(nèi)的研究尚屬空白。
　　基于此，本課題擬對α7nAChR在高糖導致的心肌微血管內(nèi)皮細胞損傷中的作用進行深入探討，以期揭示糖尿病心肌微血管內(nèi)皮細胞炎癥反應加重、血管新生能力下降背后重要的共同原因。針對這一情況進行干預，將有希望達到同時降低糖尿病心肌缺血損傷后的炎癥反應

8、及促血管新生的治療目的，一箭雙雕，有望為糖尿病缺血性心臟病的防治提供新的雙重保護的思路和靶點。
　　目的：1. 驗證高糖刺激是否是心肌微血管內(nèi)皮細胞α7nAChR 表達下調(diào)的上游原因，闡明心肌微血管內(nèi)皮細胞凋亡、血管新生能力下降及大量分泌炎癥因子與α7nAChR表達下調(diào)有關(guān)；2.進一步明確α7nAChR在CMECs高糖損傷中的相關(guān)下游分子機制。
　　方法：1.實驗一（基于目的1，所有實驗均重復3次）：
　　1.1 心肌

9、微血管內(nèi)皮細胞的原代培養(yǎng)與鑒定，根據(jù)實驗分組行正?；蚋咛桥囵B(yǎng)基（25mm/l）培養(yǎng)，同時根據(jù)分組給與α7nAChR 激動劑 GTS-21 dihydrochloride （DMBX-A）(10μ M)或α 7nACh受體抑制劑甲基牛扁堿（Methyllycaconitine）。
　　1.2 實驗分組：正常培養(yǎng)組（Con），高糖培養(yǎng)組（HG）,正常培養(yǎng)+DMBX-A組（DMBX-A），正常培養(yǎng)+s Methyllycaconitin

10、e組（Methyllycaconitine），高糖培養(yǎng)+DMBX-A 組（HG+DMBX-A），高糖培養(yǎng)+ Methyllycaconitine 組（HG+Methyllycaconitine）。
　　1.3 采用 Tunel/DAPI 免疫熒光雙標法檢測 CMECs 凋亡，Transwell 小室檢測CMECs遷移能力，In vitro vascularpermeability assy kit檢測CMECs的通透性。
　

11、　1.4 流式細胞儀檢測CMECs活性氧（ROS）的水平。
　　1.5 試劑盒分別檢測CMECs中一氧化氮（NO），一氧化氮合酶（NOS），超氧化物歧化酶（SOD）的表達水平。
　　1.6 Matrigel基質(zhì)膠培養(yǎng)檢測CMECs管樣結(jié)構(gòu)的生成來檢測血管新生成管能力。
　　2.實驗二（基于目的2，所有實驗均重復3次）：
　　2.1 心肌微血管內(nèi)皮細胞的原代培養(yǎng)與鑒定，方法與分組同實驗1.1。
　　2.2 采

12、用試劑盒（SubcellularProtein Fractionation kit for Cultured Cells）對細胞核與細胞膜分離。
　　2.3 Western雜交方法檢測CMECs中α7nAChR/JAK2/AKT/NFkB的表達情況。
　　2.4 RT-PCR檢測CMECs中iNOS/eNOS的表達情況。
　　結(jié)果：
　　1.實驗一：
　　1.1 本實驗原代分離培養(yǎng)的心肌微血管內(nèi)皮細胞低密度

13、乙酰脂蛋白熒光染色陽性，證實CMECs模型建立成功。
　　1.2 與正常培養(yǎng)相比，高糖培養(yǎng)組中的 CMECs 凋亡指數(shù)明顯增加，DMBX-A顯著減少細胞凋亡，而對于Methyllycaconitine抑制組凋亡有明顯增加。
　　1.3 與正常培養(yǎng)相比，高糖培養(yǎng)組中的 CMECs 的遷移能力減弱，DMBX-A 顯著恢復細胞遷移能力，而對于Methyllycaconitine抑制組遷移能力有明顯降低。
　　1.4 與正常培

14、養(yǎng)相比，高糖培養(yǎng)組中的單層 CMECs 的通透性增加，DMBX-A顯著降低細胞通透性，而對于Methyllycaconitine抑制組細胞通透性有加劇顯著。
　　1.5 流式細胞儀檢測結(jié)果顯示與正常培養(yǎng)相比，高糖培養(yǎng)CMECs活性氧簇的產(chǎn)生增多，DMBX-A可以明顯抑制此現(xiàn)象，而Methyllycaconitine抑制組可使ROS增多加劇。
　　1.6 與正常培養(yǎng)組相比較，高糖培養(yǎng)組CMECs所產(chǎn)NOS活力上升、NO增加同時

15、SOD減少，DMBX-A組可以減緩此趨勢，而Methyllycaconitine培養(yǎng)組加劇了NOS活力和NO的產(chǎn)生并且明顯的降低了SOD的水平。
　　1.7 采用 Matrigel 基質(zhì)膠三維成型鋪板培養(yǎng)后，與正常培養(yǎng)液組相比較，高糖培養(yǎng)組 CMECs 的成管能力降低，DMBX-A 可以提高細胞成管能力，而Methyllycaconitine組中基本沒有管樣結(jié)構(gòu)的形成。
　　2.實驗二：
　　2.1 Western b

16、lot結(jié)果顯示與正常組相比，高糖誘導的CMECs中JAK-2/p-AKT表達下調(diào)，NF-κB的表達升高，DMBX-A卻緩解了上述的現(xiàn)象，而Methyllycaconitine組中此現(xiàn)象更為明顯。
　　2.2 RT-PCR結(jié)果顯示與正常培養(yǎng)組比較，高糖培養(yǎng)的CMECs中iNOS/eNOS表達上調(diào)，DMBX-A組明顯逆轉(zhuǎn)此現(xiàn)象，Methyllycaconitine組可以明顯加劇此現(xiàn)象。
　　結(jié)論：
　　1.α7nACh 受