體外培養(yǎng)星形膠質(zhì)細胞α7尼古丁型乙酰膽堿能受體調(diào)控β-淀粉樣蛋白聚集的作用.pdf

1、目的：研究激活星形膠質(zhì)細胞內(nèi)的α7尼古丁乙酰膽堿能受體（nicotinic acetylcholine receptor, nAChR）后對調(diào)控β-淀粉樣蛋白（β-amyloid peptide, Aβ）聚集的作用。
　　方法:分離新生大鼠大腦皮質(zhì)，培養(yǎng)原代星形膠質(zhì)細胞并純化、傳代，使用細胞免疫熒光的方法鑒定細胞及純度；體外制備Aβ寡聚體；將培養(yǎng)細胞分為對照組、激動劑組、拮抗劑+激動劑組以及 Aβ組、激動劑+Aβ組、拮抗劑+激動劑

2、+Aβ組。激動劑有尼古丁、PNU、s24795，拮抗劑為甲基牛扁亭（methyllycaconitine, MLA）。用蛋白印跡法（Western blotting）和逆轉(zhuǎn)錄PCR（reverse transcription, PCR）法檢測正常星形膠質(zhì)細胞內(nèi)nAChR不同亞單位的表達；蛋白印跡法和凝膠銀染方法鑒定 Aβ寡聚體聚集情況；用 CCK-8方法測定星形膠質(zhì)細胞的存活率；使用蛋白印跡法檢測加入激動劑后α7 nAChR的表達以及A

3、β蛋白是否降解。
　　結(jié)果：采用免疫熒光法鑒定所培養(yǎng)的細胞，結(jié)果顯示星形膠質(zhì)細胞占所有細胞的95％以上。除β3外，星形膠質(zhì)細胞中α2、α3、α4、α7及β2 nAChR亞單位在蛋白及mRNA水平均有表達。體外制備的Aβ除了含少量的未聚集的單體（4 kDa)外，主要以二聚體、三聚體、九聚體等不同聚集形式的寡聚體存在；CCK-8方法顯示Aβ寡聚體對星形膠質(zhì)細胞有明顯的神經(jīng)毒性作用，并呈現(xiàn)劑量-效應關系。檢測α7 nAChR蛋白表達結(jié)果

4、顯示：（1）尼古丁組與對照組比較，尼古丁組的α7 nAChR表達明顯增高（P<0.01），MLA+尼古丁組與尼古丁組比較，加入拮抗劑組的α7 nAChR表達降低（P<0.05）；（2） PNU組與對照組比較，PNU組的α7 nAChR的表達增加（P<0.05），MLA+PNU組與PNU組相比，α7 nAChR表達降低（P<0.05）；（3）s24795組與對照比較， s24795組的α7 nAChR表達明顯升高（P<0.01），MLA+

5、s24795組與s24795組比較，加入拮抗劑組的α7 nAChR表達明顯降低（P<0.01）。檢測Aβ蛋白的表達結(jié)果為：（1）收集細胞的上清液及蛋白，分別進行檢測。對照組正常的細胞內(nèi)沒有Aβ蛋白的表達，尼古丁+Aβ組與Aβ組相比，尼古丁+Aβ組的Aβ蛋白表達均明顯降低（P<0.01），MLA+尼古丁+Aβ組與尼古丁+Aβ組比較，MLA+尼古丁+Aβ組的 Aβ蛋白的表達均明顯升高（P<0.01）；（2）收集細胞的上清液及蛋白，分別進行檢

6、測。對照組正常的細胞內(nèi)沒有Aβ蛋白的表達，PNU+Aβ組與Aβ組相比，PNU+Aβ組的蛋白表達均明顯降低（P<0.01），MLA+PNU+Aβ組與PNU+Aβ組比較，MLA+PNU+Aβ組的蛋白表達均升高（P<0.05）；（3）收集細胞的上清液及蛋白，分別進行檢測。對照組正常的細胞內(nèi)沒有Aβ蛋白的表達，s24795+Aβ組與 Aβ組相比， s24795+Aβ組的 Aβ蛋白表達均明顯降低（ P<0.01）， MLA+s24795+Aβ組與