豚鼠Ⅰ型前庭毛細(xì)胞膽堿能受體特性的研究.pdf

1、本研究分為五部分： 第一部分、Ⅰ型前庭毛細(xì)胞改良分離法 目的:探討一種能提供更多數(shù)量并更長(zhǎng)時(shí)間保留單離豚鼠Ⅰ型前庭毛細(xì)胞（VHCⅠ）細(xì)胞活性的分離方法。 方法:將耳廓反射正常的雜色豚鼠隨機(jī)分為4組,每組12 只,分別為0.25％膠原酶Ⅳ+常用分離法組（A組），0.05％胰蛋白酶+常用分離法組（B組），0.25％膠原酶Ⅳ+改良分離法組（C組）和0.05％胰蛋白酶+改良分離法組（D組）分離豚鼠Ⅰ型前庭毛細(xì)胞，通過(guò)光鏡

2、、膜片鉗、胞內(nèi)鈣成像等方法觀察、鑒定和評(píng)價(jià)VHCⅠ活性。 結(jié)果:A組平均每耳分離出存活單離VHCⅠ25個(gè)，鏡下可見(jiàn)成簇的細(xì)胞團(tuán)塊，3h 后存活細(xì)胞約14個(gè)，6h 后存活細(xì)胞約8個(gè)，3h 膜片鉗測(cè)得靜息電位平均為-55±10mV，鈣離子成像技術(shù)測(cè)得胞內(nèi)鈣離子濃度平均為105±15nmol/ L；B組平均每耳分離出存活單離VHCⅠ40個(gè)，3h 后存活細(xì)胞約19個(gè)，6h 后存活細(xì)胞約6個(gè)，3h 膜片鉗測(cè)得靜息電位平均為-60±10mV

3、，鈣離子成像技術(shù)測(cè)得胞內(nèi)鈣離子濃度平均為95±10nmol/ L；C組平均每耳分離出存活單離VHCⅠ24個(gè)，3h 后存活細(xì)胞約17個(gè)，6h后存活細(xì)胞約11個(gè)，3h 膜片鉗測(cè)得靜息電位平均為-55±10mV，鈣離子成像技術(shù)測(cè)得胞內(nèi)鈣離子濃度平均為95±15nmol/ L；D組平均每耳分離出VHCⅠ42個(gè)，鏡下成簇細(xì)胞團(tuán)塊較少，細(xì)胞與組織離解充分，3h 后存活細(xì)胞約32個(gè)，6h 后存活細(xì)胞約23個(gè)，3h 膜片鉗測(cè)得靜息電位平均為-60±10

4、mV,鈣離子成像技術(shù)測(cè)得胞內(nèi)鈣離子濃度平均為90±10nmol/ L，且胞內(nèi)鈣離子濃度更穩(wěn)定。 結(jié)論:以胰蛋白酶酶解結(jié)合改良式液體外加機(jī)械分離技術(shù)分離方法簡(jiǎn)便易行,能提供足夠量的存活時(shí)間較長(zhǎng)的單離豚鼠Ⅰ型前庭毛細(xì)胞，適用于對(duì)細(xì)胞活性要求較高的實(shí)驗(yàn)如膜片鉗電生理研究等。 第二部分、豚鼠Ⅰ型前庭毛細(xì)胞上存在膽堿能受體通道 目的:探討豚鼠Ⅰ型前庭毛細(xì)胞上有無(wú)膽堿能受體存在。 方法:應(yīng)用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)檢測(cè)豚鼠急

5、性分離的Ⅰ型前庭毛細(xì)胞（vestibular haircell typeⅠ，VHCⅠ）對(duì)乙酰膽堿（acetylcholine，Ach）的反應(yīng)特性及其濃度依賴性。 結(jié)果:7.5％（21/279）的Ⅰ型前庭毛細(xì)胞對(duì)10～1000μmol/L的Ach敏感，對(duì)Ach的反應(yīng)呈濃度依賴性（EC50=63.78±2.31μmol/L）。 結(jié)論:部分豚鼠Ⅰ型前庭毛細(xì)胞上存在膽堿能受體，胞外給予Ach（10 ～1000μmol/L）可激活

6、一持久緩慢的外向電流，Ⅰ型前庭毛細(xì)胞的膽堿能受體通道對(duì)于Ach的作用呈現(xiàn)濃度依賴性。 第三部分、豚鼠Ⅰ型前庭毛細(xì)胞上膽堿能受體通道電生理特性的研究 目的:對(duì)豚鼠Ⅰ型前庭毛細(xì)胞上膽堿能受體介導(dǎo)的離子通道的特性進(jìn)行研究。 方法:應(yīng)用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)，檢測(cè)豚鼠急性分離的Ⅰ型前庭毛細(xì)胞（vestibular haircell typeⅠ，VHCⅠ）對(duì)乙酰膽堿（acetylcholine，Ach）的電流特性。 結(jié)果

7、:豚鼠Ⅰ型前庭毛細(xì)胞上膽堿受體誘發(fā)電流為非電壓依賴性。在-50mV 鉗制電壓和正常細(xì)胞外液中，100μmol/L 乙酰膽堿激活一持久緩慢的外向電流，電流幅值為170±15pA。VHCⅠ的再次激活時(shí)間不小于1min。在長(zhǎng)時(shí)間暴露在Ach的情況下，受體離子通道不會(huì)發(fā)生自發(fā)性關(guān)閉。 結(jié)論:胞外給予Ach（10～1000μmol/L）部分豚鼠Ⅰ型前庭毛細(xì)胞上可激活一持久緩慢的外向電流，Ⅰ型前庭毛細(xì)胞的膽堿能受體通道對(duì)于Ach的作用呈現(xiàn)外

8、鈣依賴性，非電壓依賴性或失敏性。 第四部分、膽堿能激動(dòng)劑對(duì)豚鼠Ⅰ型前庭毛細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的影響 目的:通過(guò)觀察膽堿能受體激動(dòng)劑對(duì)豚鼠Ⅰ型前庭毛細(xì)胞(VHC Ⅰ)胞內(nèi)鈣離子濃度([Ca2+]I)的影響，探討前庭毛細(xì)胞膜所存在的膽堿能受體及其分型，檢驗(yàn)該細(xì)胞上膽堿能受體的脫敏現(xiàn)象。 方法:用胰蛋白酶消化結(jié)合機(jī)械分離法，分離豚鼠VHCⅠ，熒光探針Fura-2 染色后在熒光倒置顯微鏡下記錄VHCⅠ胞內(nèi)游離鈣離子濃度的動(dòng)態(tài)

9、變化。 結(jié)果:① 非選擇性膽堿能受體激動(dòng)劑乙酰膽堿(Ach)、M型膽堿能受體激動(dòng)劑毒蕈堿（muscarine）在正常細(xì)胞外液中均可引起大部分（21/25，14/18）單離VHCⅠ[Ca2+]I的升高，但無(wú)鈣外液中Ach、muscarine僅使少部分（3/20，2/16）VHCⅠ[Ca2+]I升高且作用減弱；正常外液中，N型受體激動(dòng)劑尼古丁(nicotine)僅在高濃度(≥10 mmol／L)時(shí)引起部分(7/32) VHCⅠ[Ca

10、2+]I升高，在低濃度時(shí)對(duì)胞內(nèi)鈣離子濃度影響不明顯，無(wú)鈣外液中，10 mmol／L nicotine對(duì)胞內(nèi)鈣離子濃度影響不明顯。② Ach引起VHCⅠ內(nèi)[Ca2+]I升高在同一細(xì)胞可重復(fù)出現(xiàn)，不存在脫敏現(xiàn)象③ M型膽堿能受體拮抗劑阿托品（atropine）可抑制Ach引起的VHCⅠ[Ca2+]I的升高，N型膽堿能受體拮抗劑筒箭毒素（d-TC）對(duì)Ach引起的VHCⅠ[Ca2+]I的升高具有競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用。④ 分別以m1、m2、m3、m4型

11、膽堿能受體拮抗劑pirenzepine、methoctramine、4-DAMP、tropicamide預(yù)孵育VHCⅠ5min后胞外給予Ach，均可引起[Ca2+]I ratio值升高幅度降低，但pirenzepine、4-DAMP和tropicamide對(duì)Ach對(duì)再次引起VHCⅠ[Ca2+]I ratio值升高的抑制作用不明顯，methoctramine預(yù)孵育后細(xì)胞的[Ca2+]I ratio的升高幅度較首次正常外液中給予100μmo

12、l/L Ach后[Ca2+]I ratio值升高幅度降低約35±10％。 結(jié)論:豚鼠Ⅰ型前庭毛細(xì)胞膜上存在M 型和N 型兩種亞型的膽堿能受體，Ach對(duì)VHCⅠ內(nèi)[Ca2+]I升高的作用主要以激動(dòng)m2型膽堿能受體為主；胞外鈣內(nèi)流是[Ca2+]I升高的主要途徑；豚鼠Ⅰ型前庭毛細(xì)胞膜上的膽堿能受體對(duì)乙酰膽堿無(wú)脫敏現(xiàn)象。 第五部分、豚鼠Ⅰ型前庭毛細(xì)胞上乙酰膽堿敏感性電流的胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制 目的:本文探討了豚鼠Ⅰ型前庭毛細(xì)

13、胞上膽堿能受體介導(dǎo)的乙酰膽堿敏感性電流胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。 方法:應(yīng)用膜片鉗技術(shù)檢測(cè)急性分離的豚鼠Ⅰ型前庭毛細(xì)胞（vestibular hair celltypeⅠ，VHCⅠ）上乙酰膽堿敏感性電流的胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。 結(jié)果:在-50mV 鉗制電壓和正常細(xì)胞外液中，100μmol/L 乙酰膽堿在豚鼠Ⅰ型前庭毛細(xì)胞上激活一持久緩慢的外向電流，大電導(dǎo)鈣依賴性鉀通道（BK）選擇性阻斷劑北非蝎毒素（CTX）可大幅度抑制IACh，小電

14、導(dǎo)鈣依賴性鉀通道（SK）選擇性阻斷劑蜂毒明肽（apamin）對(duì)IACh的影響不明顯，IACh 可被M 型膽堿能受體拮抗劑阿托品（atropine）和N 型膽堿能受體拮抗劑筒箭毒素（d-TC）競(jìng)爭(zhēng)性抑制；m2 型膽堿能受體選擇性拮抗劑methoctramine 可抑制VHCⅠ上引發(fā)的IACh，m1、、m3、m4型膽堿能受體拮抗劑pirenzepine、4-DAMP、tropicamide 對(duì)VHCⅠ上IACh 作用不明顯；G蛋白抑制劑百日

15、咳毒素（PTX）可使IACh 幅值減小，非水解性GTP 類似物GTP-γ-s 可增大IACh 幅值；IP3 受體拮抗劑肝素（heparin），PKG 抑制劑KT5823，PKC 特異選擇性抑制劑BIM 對(duì)豚鼠Ⅰ型前庭毛細(xì)胞上IACh的影響不明顯，PKA 抑制劑H-89 可明顯抑制IACh，胞外應(yīng)用PKA 激動(dòng)劑forskolin 可激活一類似IACh 電流；胞外應(yīng)用cAMP 膜可滲透性類似物db-cAMP 可激活一類似IACh 電流，c