豚鼠Ⅰ型前庭毛細胞膽堿能受體特性的研究.pdf

1、本研究分為五部分： 第一部分、Ⅰ型前庭毛細胞改良分離法 目的:探討一種能提供更多數量并更長時間保留單離豚鼠Ⅰ型前庭毛細胞（VHCⅠ）細胞活性的分離方法。 方法:將耳廓反射正常的雜色豚鼠隨機分為4組,每組12 只,分別為0.25％膠原酶Ⅳ+常用分離法組（A組），0.05％胰蛋白酶+常用分離法組（B組），0.25％膠原酶Ⅳ+改良分離法組（C組）和0.05％胰蛋白酶+改良分離法組（D組）分離豚鼠Ⅰ型前庭毛細胞，通過光鏡

2、、膜片鉗、胞內鈣成像等方法觀察、鑒定和評價VHCⅠ活性。 結果:A組平均每耳分離出存活單離VHCⅠ25個，鏡下可見成簇的細胞團塊，3h 后存活細胞約14個，6h 后存活細胞約8個，3h 膜片鉗測得靜息電位平均為-55±10mV，鈣離子成像技術測得胞內鈣離子濃度平均為105±15nmol/ L；B組平均每耳分離出存活單離VHCⅠ40個，3h 后存活細胞約19個，6h 后存活細胞約6個，3h 膜片鉗測得靜息電位平均為-60±10mV

3、，鈣離子成像技術測得胞內鈣離子濃度平均為95±10nmol/ L；C組平均每耳分離出存活單離VHCⅠ24個，3h 后存活細胞約17個，6h后存活細胞約11個，3h 膜片鉗測得靜息電位平均為-55±10mV，鈣離子成像技術測得胞內鈣離子濃度平均為95±15nmol/ L；D組平均每耳分離出VHCⅠ42個，鏡下成簇細胞團塊較少，細胞與組織離解充分，3h 后存活細胞約32個，6h 后存活細胞約23個，3h 膜片鉗測得靜息電位平均為-60±10

4、mV,鈣離子成像技術測得胞內鈣離子濃度平均為90±10nmol/ L，且胞內鈣離子濃度更穩(wěn)定。 結論:以胰蛋白酶酶解結合改良式液體外加機械分離技術分離方法簡便易行,能提供足夠量的存活時間較長的單離豚鼠Ⅰ型前庭毛細胞，適用于對細胞活性要求較高的實驗如膜片鉗電生理研究等。 第二部分、豚鼠Ⅰ型前庭毛細胞上存在膽堿能受體通道 目的:探討豚鼠Ⅰ型前庭毛細胞上有無膽堿能受體存在。 方法:應用全細胞膜片鉗技術檢測豚鼠急

5、性分離的Ⅰ型前庭毛細胞（vestibular haircell typeⅠ，VHCⅠ）對乙酰膽堿（acetylcholine，Ach）的反應特性及其濃度依賴性。 結果:7.5％（21/279）的Ⅰ型前庭毛細胞對10～1000μmol/L的Ach敏感，對Ach的反應呈濃度依賴性（EC50=63.78±2.31μmol/L）。 結論:部分豚鼠Ⅰ型前庭毛細胞上存在膽堿能受體，胞外給予Ach（10 ～1000μmol/L）可激活

6、一持久緩慢的外向電流，Ⅰ型前庭毛細胞的膽堿能受體通道對于Ach的作用呈現濃度依賴性。 第三部分、豚鼠Ⅰ型前庭毛細胞上膽堿能受體通道電生理特性的研究 目的:對豚鼠Ⅰ型前庭毛細胞上膽堿能受體介導的離子通道的特性進行研究。 方法:應用全細胞膜片鉗技術，檢測豚鼠急性分離的Ⅰ型前庭毛細胞（vestibular haircell typeⅠ，VHCⅠ）對乙酰膽堿（acetylcholine，Ach）的電流特性。 結果

7、:豚鼠Ⅰ型前庭毛細胞上膽堿受體誘發(fā)電流為非電壓依賴性。在-50mV 鉗制電壓和正常細胞外液中，100μmol/L 乙酰膽堿激活一持久緩慢的外向電流，電流幅值為170±15pA。VHCⅠ的再次激活時間不小于1min。在長時間暴露在Ach的情況下，受體離子通道不會發(fā)生自發(fā)性關閉。 結論:胞外給予Ach（10～1000μmol/L）部分豚鼠Ⅰ型前庭毛細胞上可激活一持久緩慢的外向電流，Ⅰ型前庭毛細胞的膽堿能受體通道對于Ach的作用呈現外

8、鈣依賴性，非電壓依賴性或失敏性。 第四部分、膽堿能激動劑對豚鼠Ⅰ型前庭毛細胞內鈣離子濃度的影響 目的:通過觀察膽堿能受體激動劑對豚鼠Ⅰ型前庭毛細胞(VHC Ⅰ)胞內鈣離子濃度([Ca2+]I)的影響，探討前庭毛細胞膜所存在的膽堿能受體及其分型，檢驗該細胞上膽堿能受體的脫敏現象。 方法:用胰蛋白酶消化結合機械分離法，分離豚鼠VHCⅠ，熒光探針Fura-2 染色后在熒光倒置顯微鏡下記錄VHCⅠ胞內游離鈣離子濃度的動態(tài)

9、變化。 結果:① 非選擇性膽堿能受體激動劑乙酰膽堿(Ach)、M型膽堿能受體激動劑毒蕈堿（muscarine）在正常細胞外液中均可引起大部分（21/25，14/18）單離VHCⅠ[Ca2+]I的升高，但無鈣外液中Ach、muscarine僅使少部分（3/20，2/16）VHCⅠ[Ca2+]I升高且作用減弱；正常外液中，N型受體激動劑尼古丁(nicotine)僅在高濃度(≥10 mmol／L)時引起部分(7/32) VHCⅠ[Ca

10、2+]I升高，在低濃度時對胞內鈣離子濃度影響不明顯，無鈣外液中，10 mmol／L nicotine對胞內鈣離子濃度影響不明顯。② Ach引起VHCⅠ內[Ca2+]I升高在同一細胞可重復出現，不存在脫敏現象③ M型膽堿能受體拮抗劑阿托品（atropine）可抑制Ach引起的VHCⅠ[Ca2+]I的升高，N型膽堿能受體拮抗劑筒箭毒素（d-TC）對Ach引起的VHCⅠ[Ca2+]I的升高具有競爭性抑制作用。④ 分別以m1、m2、m3、m4型

11、膽堿能受體拮抗劑pirenzepine、methoctramine、4-DAMP、tropicamide預孵育VHCⅠ5min后胞外給予Ach，均可引起[Ca2+]I ratio值升高幅度降低，但pirenzepine、4-DAMP和tropicamide對Ach對再次引起VHCⅠ[Ca2+]I ratio值升高的抑制作用不明顯，methoctramine預孵育后細胞的[Ca2+]I ratio的升高幅度較首次正常外液中給予100μmo

12、l/L Ach后[Ca2+]I ratio值升高幅度降低約35±10％。 結論:豚鼠Ⅰ型前庭毛細胞膜上存在M 型和N 型兩種亞型的膽堿能受體，Ach對VHCⅠ內[Ca2+]I升高的作用主要以激動m2型膽堿能受體為主；胞外鈣內流是[Ca2+]I升高的主要途徑；豚鼠Ⅰ型前庭毛細胞膜上的膽堿能受體對乙酰膽堿無脫敏現象。 第五部分、豚鼠Ⅰ型前庭毛細胞上乙酰膽堿敏感性電流的胞內信號轉導機制 目的:本文探討了豚鼠Ⅰ型前庭毛細

13、胞上膽堿能受體介導的乙酰膽堿敏感性電流胞內信號轉導機制。 方法:應用膜片鉗技術檢測急性分離的豚鼠Ⅰ型前庭毛細胞（vestibular hair celltypeⅠ，VHCⅠ）上乙酰膽堿敏感性電流的胞內信號轉導機制。 結果:在-50mV 鉗制電壓和正常細胞外液中，100μmol/L 乙酰膽堿在豚鼠Ⅰ型前庭毛細胞上激活一持久緩慢的外向電流，大電導鈣依賴性鉀通道（BK）選擇性阻斷劑北非蝎毒素（CTX）可大幅度抑制IACh，小電

14、導鈣依賴性鉀通道（SK）選擇性阻斷劑蜂毒明肽（apamin）對IACh的影響不明顯，IACh 可被M 型膽堿能受體拮抗劑阿托品（atropine）和N 型膽堿能受體拮抗劑筒箭毒素（d-TC）競爭性抑制；m2 型膽堿能受體選擇性拮抗劑methoctramine 可抑制VHCⅠ上引發(fā)的IACh，m1、、m3、m4型膽堿能受體拮抗劑pirenzepine、4-DAMP、tropicamide 對VHCⅠ上IACh 作用不明顯；G蛋白抑制劑百日

15、咳毒素（PTX）可使IACh 幅值減小，非水解性GTP 類似物GTP-γ-s 可增大IACh 幅值；IP3 受體拮抗劑肝素（heparin），PKG 抑制劑KT5823，PKC 特異選擇性抑制劑BIM 對豚鼠Ⅰ型前庭毛細胞上IACh的影響不明顯，PKA 抑制劑H-89 可明顯抑制IACh，胞外應用PKA 激動劑forskolin 可激活一類似IACh 電流；胞外應用cAMP 膜可滲透性類似物db-cAMP 可激活一類似IACh 電流，c