大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）分化為表皮細(xì)胞及皮損修復(fù)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的： 探討骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞利用特定的誘導(dǎo)劑體外誘導(dǎo)分化為表皮細(xì)胞的可能性及MSCs單獨(dú)或與必要的誘導(dǎo)劑組合移植修復(fù)皮膚創(chuàng)面缺損與重建表皮的實(shí)驗(yàn)研究，為臨床應(yīng)用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療大面積燒傷等疾病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法： 1．大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)的分離培養(yǎng)、擴(kuò)增與鑒定：取健康0.2kg左右Wistar大鼠一只，麻醉后在無菌的條件下取股骨和脛骨，剪斷骨骺端，用無血清DMEM培養(yǎng)基沖出骨髓腔中的細(xì)胞后，用淋

2、巴細(xì)胞分離液(比重1.077g/ml)密度梯度離心法分離單個(gè)核細(xì)胞(MNC)，以含10％胎牛血清DMEM培養(yǎng)基洗滌2次，以1×105cells/cm2密度接種于培養(yǎng)瓶孵育。2天后半量換液，4天時(shí)完全換液，棄去未貼壁細(xì)胞，貼壁細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)，以后每2-3天換液1次，14天后當(dāng)細(xì)胞融合達(dá)80％左右時(shí)，用胰蛋白酶消化傳代。定期觀察細(xì)胞的生長情況，細(xì)胞傳至第4代后用流式細(xì)胞儀分析CD34、CD29、CD90、CD45的表達(dá)情況，從而鑒定間充質(zhì)干細(xì)

3、胞。 2．MSCs誘導(dǎo)分化成表皮細(xì)胞及其鑒定：將第4代細(xì)胞按106的密度接種于6孔培養(yǎng)板中，用含20％的燒傷大鼠血清的DMEM-F12培養(yǎng)基孵育，每3-4天換液一次，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到90％融合時(shí)，用胰蛋白酶消化傳代，于第14天用免疫細(xì)胞化學(xué)染色及流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞角蛋白(CK)陽性細(xì)胞即表皮細(xì)胞的表達(dá)情況。 3．動(dòng)物移植實(shí)驗(yàn)：動(dòng)物模型制備及誘導(dǎo)后的MSCs與未經(jīng)誘導(dǎo)的MSCs回植選取24只健康Wistar大鼠，平均體重為200

4、g，雌雄各半，分為三組，每組八只，即治療組A(經(jīng)誘導(dǎo)的MSCs組)、治療組B(未經(jīng)誘導(dǎo)的MSCs組)和對(duì)照組C(無MSCs移植組)：大鼠背部正中線處，各制造直徑約為5cm的圓形全層皮膚缺損創(chuàng)面，立即以I型膠原為載體，將BrdU標(biāo)記的自體MSCs及含有經(jīng)誘導(dǎo)的MSCs分別單次涂布到治療組A、B的創(chuàng)面上，而對(duì)照組C組僅在創(chuàng)面上涂布Ⅰ型膠原，各組創(chuàng)面上均敷凡士林紗布，然后采用打包法進(jìn)行縫合固定后單籠飼養(yǎng)。 4．創(chuàng)面觀察接種后，切觀察創(chuàng)

5、面情況，于術(shù)后第14天將創(chuàng)面大小描印于無菌透明薄膜上，按公式計(jì)算創(chuàng)口收縮率，記錄治療組和對(duì)照組愈合時(shí)間。 創(chuàng)口收縮率(％)=閉合創(chuàng)面面積／原創(chuàng)面面積×100％ 5．病理學(xué)及免疫組織化學(xué)染色檢查于4周后選擇實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，取創(chuàng)面中央直徑1cm范圍的皮膚，制成石蠟切片，用蘇木精-伊紅染色法(HE染色)染色，光鏡下觀察皮膚結(jié)構(gòu)。同時(shí)，連續(xù)切片，采用SABC免疫組化檢測(cè)。嚴(yán)格按博士德公司試劑盒說明書操作，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色。鼠

6、抗BrdU單克隆抗體(北京中衫金橋生物公司)工作濃度1：100，二抗羊抗鼠抗體工作濃度1：100。于顯微鏡下觀察染色結(jié)果，細(xì)胞核呈棕黃色的細(xì)胞為BrdU陽性細(xì)胞。 結(jié)果： 1．MSCs的分離培養(yǎng)、擴(kuò)增與鑒定：細(xì)胞接種4天后首次完全換液，棄去未貼壁的細(xì)胞，貼壁的細(xì)胞即為MSCs，此細(xì)胞形態(tài)長梭形，類似成纖維細(xì)胞，呈團(tuán)、簇狀分布。14天時(shí)細(xì)胞貼滿瓶底，此時(shí)呈魚群樣、漩渦狀、輻射狀或網(wǎng)狀排列。傳代后細(xì)胞增殖迅速，一般2-3天可

7、傳一代。流式細(xì)胞術(shù)分析MSCs結(jié)果顯示，CD34表達(dá)率為2.65±0.56％、CD29表達(dá)率為96.87±2.54％、CD90表達(dá)率為90.37±3.55％、CD45表達(dá)率為1.62±0.16％。 2．表皮細(xì)胞的鑒定：經(jīng)20％的燒傷大鼠血清誘導(dǎo)MSCs14天后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞角蛋白(cytokeratin CK)陽性細(xì)胞即表皮細(xì)胞的表達(dá)率為7.22％，而未經(jīng)誘導(dǎo)的CK陽性細(xì)胞的表達(dá)率為0.23％。同時(shí)，按免疫組化方法染色，

8、檢測(cè)胞漿呈棕黃色的CK陽性細(xì)胞即為表皮細(xì)胞。 3．創(chuàng)面觀察：術(shù)后兩組創(chuàng)面均較干燥，面積逐日縮小，無明顯感染征象．術(shù)后第14天治療組A創(chuàng)面平均收縮率為78.2％±9.8％、治療組B創(chuàng)面平均收縮率為79.1％±10.4％，對(duì)照組C創(chuàng)面平均收縮率為70.7％±10.2％，各兩組間(A組與C組、B組與C組)均有顯著性差異(P<0.05)，而兩治療組間(A組與B組)差距無顯著性(P>0.05)；創(chuàng)面平均愈合時(shí)間分別是治療組A為15.4％±

9、0.9d，治療組B為16.0％±1.2d，對(duì)照組C為19.5±1.0d，各兩組間(A組與C組、B組與C組)均有顯著性差異(P<0.05)，而兩治療組間(A組與B組)無顯著性差異(P>0.05)。 4．MSCs單獨(dú)或與誘導(dǎo)劑組合移植皮膚再生作用比較：(1)常規(guī)病理學(xué)觀察：在第4周三組再生皮膚病理切片中，治療A、B組再生皮膚附件明顯豐富，表皮細(xì)胞數(shù)目顯著增多，細(xì)胞層次增多，表皮層明顯增厚。(2)免疫組織化學(xué)染色結(jié)果：在第4周治療A、

10、B組再生皮膚組織切片中均可見BrdU染色陽性細(xì)胞，陽性細(xì)胞多位于皮膚附件毛囊內(nèi)層上皮根鞘以及再生表皮的基底層、棘層，在形態(tài)學(xué)上此類細(xì)胞呈立方形或多邊形，與周圍表皮細(xì)胞無明顯差異，且可見其相鄰生長。 結(jié)論： 1．骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)燒傷大鼠血清誘導(dǎo)后，可以向表皮細(xì)胞方向分化，說明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在特定誘導(dǎo)劑作用下,具有向外胚層組織細(xì)胞分化的潛能。 2．比較MSCs單獨(dú)移植組和與必要的誘導(dǎo)劑組合移植組，其皮膚創(chuàng)面在平均