紅景天苷誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為肝細(xì)胞以及治療免疫性肝纖維化的體外、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一章、緒論 肝臟是體內(nèi)最大的消化腺和“化學(xué)工廠”，在糖、脂肪和蛋白質(zhì)的合成、分解與代謝，形成以及分泌膽汁，調(diào)節(jié)內(nèi)分泌，參與凝血以及機(jī)體的免疫以及降解機(jī)體代謝產(chǎn)物和解毒等多個(gè)方面發(fā)揮著重要的作用，所以肝臟一旦發(fā)病就嚴(yán)重威脅人類(lèi)的身體健康，也是人類(lèi)因疾病死亡的主要原因之一。 從治療角度來(lái)講，肝臟疾病的治療不外乎以下幾個(gè)方面：對(duì)因治療、對(duì)癥治療、保肝及營(yíng)養(yǎng)支持、基因治療、肝移植、人工肝支持治療以及細(xì)胞移植等等。但是，肝移植是

2、目前臨床上治療肝臟疾病的最后手段，該技術(shù)日臻成熟，挽救了不少肝功能衰竭患者的生命.但由于供肝來(lái)源困難，免疫抑制劑的終生應(yīng)用，手術(shù)費(fèi)用昂貴等諸多因素，大大限制了肝移植在臨床上的普及應(yīng)用。肝細(xì)胞移植是新興起的一種先進(jìn)療法，可部分克服肝臟移植的難題，與肝移植相比有以下優(yōu)點(diǎn)：手術(shù)簡(jiǎn)單、創(chuàng)傷小，費(fèi)用低廉；來(lái)源相對(duì)豐富；細(xì)胞可凍存?zhèn)溆?，不?huì)因供體短缺造成患者死亡；與肝移植相比，免疫原性弱，無(wú)需終生使用免疫抑制劑。 解決免疫排斥最好的辦法是使

3、用自體細(xì)胞；解決增殖問(wèn)題是使用干細(xì)胞。目前的醫(yī)學(xué)倫理基本上已經(jīng)排除了使用胎肝細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞的可能。最近有文獻(xiàn)報(bào)道，作為人體重要成體干細(xì)胞之一，MSCs能在體內(nèi)外分化成肝細(xì)胞，且MSCs來(lái)源豐富，這提示自體MSCs治療肝臟疾病是一種非常有前途的新療法。 我們課題組從體外誘導(dǎo)MSCs分化為肝細(xì)胞到移植MSCs治療肝臟疾病實(shí)驗(yàn)，也只是試圖從一個(gè)側(cè)面繼續(xù)探求MSCs體外分化的機(jī)理、新藥研發(fā)的新途徑；驗(yàn)證MSCs治療慢性免疫性肝纖維化的

4、作用，建立由體外實(shí)驗(yàn)到體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的橋梁以及探討MSCs逆轉(zhuǎn)/緩解肝纖維化、改善肝臟功能的具體作用機(jī)制；也寄希望將MSCs迅速推向臨床，為肝臟疾病患者帶來(lái)新的福音，同時(shí)發(fā)展干細(xì)胞和中藥相關(guān)產(chǎn)業(yè)，為醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)開(kāi)辟新的增長(zhǎng)點(diǎn)。 第二章、MSCs的分離、培養(yǎng)及鑒定 目的：優(yōu)化大鼠MSCs體外分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增的有效方法，探討其部分生物學(xué)特性以及分化潛能。 方法：在無(wú)菌條件下快速處死SD大鼠，收集骨髓細(xì)胞，快速懸浮于預(yù)冷的NH4

5、C1低滲鹽溶液中裂解紅細(xì)胞，離心去上清，收集沉淀的細(xì)胞，D-Hank's充分洗滌后，用含10％的低糖型DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)；傳代時(shí)，采用膠原酶Ⅳ預(yù)先孵育1～2小時(shí)，再用胰蛋白酶-EDTA處理。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的一般形態(tài)結(jié)構(gòu)；繪制生長(zhǎng)曲線了解其生長(zhǎng)特性；流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)CD45、CD44、CD90等表面抗原的表達(dá)情況；用成骨、軟骨以及脂肪方向分化的誘導(dǎo)液誘導(dǎo)MSCs向這三個(gè)方向分化，檢測(cè)其多向分化潛能。 結(jié)果：原代培養(yǎng)的細(xì)

6、胞接種4-6小時(shí)后有細(xì)胞貼壁，4～6天后細(xì)胞增殖速度明顯增快，7～8天原代細(xì)胞匯合達(dá)80％-90％，原代及傳代細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察均成典型的成纖維樣形態(tài)特征，旋渦狀生長(zhǎng)態(tài)勢(shì)；傳代培養(yǎng)的細(xì)胞在3天時(shí)增殖速度最快，5～6天時(shí)達(dá)到平臺(tái)期；細(xì)胞可以連續(xù)傳代20代而未見(jiàn)衰老現(xiàn)象，單個(gè)細(xì)胞可以擴(kuò)增30倍左右。 結(jié)論：采用低滲鹽溶液裂解紅細(xì)胞，離心收集MSCs，再進(jìn)行常規(guī)貼壁培養(yǎng)可以分離更為純化的MSCs；在含10％FBS的低糖DMEM培養(yǎng)基中可穩(wěn)

7、定傳代20代左右，細(xì)胞的性狀沒(méi)有發(fā)生改變；根據(jù)細(xì)胞鑒定結(jié)果，該細(xì)胞具有以下特征：貼附塑料器皿生長(zhǎng)的特性；表達(dá)MSCs特殊的表面抗原如CD44、CD90等；不表達(dá)造血系細(xì)胞的表面抗原如CD45等；具有向成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和成軟骨細(xì)胞等胚層細(xì)胞方向分化的能力。所以，該細(xì)胞是MSCs；結(jié)合低滲裂解紅細(xì)胞及常規(guī)貼壁培養(yǎng)方法，使得分離、培養(yǎng)及擴(kuò)增MSCs更為方便。 第三章、紅景天苷誘導(dǎo)MSCs分化為肝細(xì)胞的體外實(shí)驗(yàn)研究 目的：建立

8、并優(yōu)化誘導(dǎo)MSCs分化為肝細(xì)胞的體外誘導(dǎo)系統(tǒng)；篩選能夠誘導(dǎo)MSCs分化為肝細(xì)胞的中藥小分子化合物；對(duì)誘導(dǎo)分化的肝細(xì)胞進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)；探索由體外實(shí)驗(yàn)到體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的銜接過(guò)程。 方法：采用第五代的MSCs進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。 （1）紅景天苷和成纖維生長(zhǎng)因子4聯(lián)合應(yīng)用對(duì)MSCs肝向分化的誘導(dǎo)作用 將MSCs接種到含10％胎牛血清的普通高糖型DMEM培養(yǎng)液中，細(xì)胞匯合后，換用含2％胎牛血清的預(yù)誘導(dǎo)培養(yǎng)液維持24小時(shí)

9、；隨后改用含2％FBS、紅景天苷2μM及FGF410ng/ml的高糖型DMEM分化誘導(dǎo)培養(yǎng)液進(jìn)行誘導(dǎo)。HGF及FGF4聯(lián)合應(yīng)用組作為陽(yáng)性對(duì)照；FGF4單獨(dú)誘導(dǎo)組作為陰性對(duì)照。倒置顯微鏡下每日觀察誘導(dǎo)后細(xì)胞形態(tài)的變化；在每個(gè)誘導(dǎo)階段末，收獲誘導(dǎo)細(xì)胞，提取RNA和蛋白，檢測(cè)肝細(xì)胞特異性相關(guān)基因以及蛋白的表達(dá)情況；在每個(gè)誘導(dǎo)階段結(jié)束后，檢測(cè)細(xì)胞的糖原合成及貯存能力、誘導(dǎo)性P450活性、低密度脂蛋白的攝取以及AFP、ALB以及CK18的表達(dá)情況

10、。 （2）紅景天苷對(duì)MSCs肝向分化的單獨(dú)誘導(dǎo)作用 接種及預(yù)誘導(dǎo)方法如上所述。誘導(dǎo)液為在基礎(chǔ)誘導(dǎo)液的基礎(chǔ)上添加紅景天苷至終濃度為10μM、20μM以及50μM。HGF及FGF4聯(lián)合應(yīng)用組作為陽(yáng)性對(duì)照；FGF4單獨(dú)誘導(dǎo)組作為陰性對(duì)照。誘導(dǎo)后的第7、14天分別收獲細(xì)胞，檢測(cè)肝特異性蛋白AFP和白蛋白的表達(dá)。 （3）紅景天苷誘導(dǎo)MSCs肝向分化機(jī)制探討 接種及預(yù)誘導(dǎo)方法如上所述。誘導(dǎo)液為在基礎(chǔ)誘導(dǎo)液的基礎(chǔ)上添加

11、紅景天苷至終濃度為20μM，在此基礎(chǔ)上，依照添加的抑制劑的不同而分為三組。紅景天苷組作為陽(yáng)性對(duì)照；基礎(chǔ)誘導(dǎo)液組作為陰性對(duì)照。誘導(dǎo)后的第7、14天分別收獲細(xì)胞，檢測(cè)肝特異性蛋白AFP和白蛋白的表達(dá)。 結(jié)果： （1）未誘導(dǎo)細(xì)胞傳代后仍呈成纖維樣，但是由漩渦狀生長(zhǎng)的特征逐步演變成過(guò)度生長(zhǎng)的狀態(tài)。 （2）紅景天苷在10μM及其以上具有單獨(dú)誘導(dǎo)MSCs分化為肝細(xì)胞的作用，細(xì)胞在分化早、中期可以表達(dá)肝特異性蛋白AFP，在誘導(dǎo)

12、中、晚期細(xì)胞表達(dá)蛋白ALB，且表達(dá)呈劑量依賴(lài)性的特點(diǎn)；但是在20μM以上則不具有更強(qiáng)的誘導(dǎo)能力，但對(duì)細(xì)胞也無(wú)明顯的毒副作用。 （3）在阻滯劑的作用下，MSCs整體生長(zhǎng)不佳，表達(dá)AFP以及ALB的能力也不一樣，總的來(lái)講， ERK1/2和PI3K信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在MSCs的肝向分化過(guò)程中起著主要的作用。 結(jié)論：紅景天苷聯(lián)合誘導(dǎo)啟動(dòng)因子FGF4可以誘導(dǎo)MSCs分化為肝細(xì)胞，分化而來(lái)的肝細(xì)胞具有合成AFP、白蛋白，貯存糖原、分泌尿素

13、、吸收LDL和誘導(dǎo)性P450活性等一系列肝細(xì)胞所具有的功能；紅景天苷可以單獨(dú)誘導(dǎo)MSCs分化為肝細(xì)胞。紅景天苷在10μM以上具有單獨(dú)誘導(dǎo)MSCs分化為肝細(xì)胞的作用，呈劑量依賴(lài)性的特點(diǎn)；但是在20μM以上則不具有更強(qiáng)的誘導(dǎo)能力，但也無(wú)明顯的毒副作用；紅景天苷在單獨(dú)誘導(dǎo)MSCs分化為肝細(xì)胞的過(guò)程中，ERK1/2和PI3K信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在MSCs的肝向分化過(guò)程中起著主要的作用。 第四章、MSCs移植治療慢性免疫性肝纖維化的實(shí)驗(yàn)研究

14、 目的：檢測(cè)MSCs移植對(duì)慢性免疫性肝纖維化大鼠的肝纖維化治療情況以及肝臟功能的恢復(fù)程度，評(píng)價(jià)MSCs移植對(duì)慢性免疫性肝纖維化的治療效果。 方法：通過(guò)腹腔注射豬血清制造大鼠免疫性肝纖維化模型，注射等量生理鹽水組大鼠作為對(duì)照，在第五周初，將成模大鼠隨機(jī)分6組：模型對(duì)照組、MSCs移植組、MSCs移植組、MSCs移植組、MSCs移植組結(jié)合紅景天苷組以及紅景天苷組等6組，以后繼續(xù)腹腔注射豬血清持續(xù)至第八周.實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，殺死大鼠，采血

15、取血清，稱(chēng)肝重，計(jì)算肝臟指數(shù)；檢測(cè)血清各項(xiàng)生化指標(biāo)，包括總蛋白，ALB，堿性磷酸酶，天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶，或稱(chēng)谷草轉(zhuǎn)氨酶，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶，或稱(chēng)谷草轉(zhuǎn)氨酶和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1等；測(cè)定血清和肝組織中的羥脯氨酸以及還原型谷胱甘肽濃度；進(jìn)行肝臟組織病理學(xué)檢查等。 結(jié)果：從大體解剖學(xué)上來(lái)看，正常組肝臟呈紅褐色，表面光滑，質(zhì)地柔軟，色澤明亮；模型組肝臟表面粗糙，腫大，有大量纖維狀點(diǎn)，色澤發(fā)暗，質(zhì)地較硬；MSCs移植能改善肝臟功能狀態(tài)，且改善

16、程度呈劑量依賴(lài)性，紅景天苷MSCs對(duì)改善肝臟功能具有協(xié)同作用。從生化指標(biāo)上來(lái)看，MSCs移植對(duì)肝臟具有保護(hù)作用，肝臟功能得到明顯改善，紅景天苷具有協(xié)同作用。HE常規(guī)染色以及偶氮卡紅染色顯示，正常組肝臟組織切片肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞排列整齊，色澤均勻明亮，匯管區(qū)基本無(wú)膠原分布；模型組可見(jiàn)大量肝纖維化組織增生，細(xì)胞排列紊亂，色澤明顯發(fā)暗，部分肝組織形成假小葉；MSCs移植能糾正肝細(xì)胞排列的紊亂狀態(tài)，減輕肝纖維化程度，且改善程度基本呈移植細(xì)胞

17、數(shù)量依賴(lài)性，紅景天苷對(duì)肝纖維化具有一定的緩解及逆轉(zhuǎn)作用，在與MSCs協(xié)同作用下，肝纖維化程度明顯降低，肝功能改善也更為明顯。 結(jié)論： （1）中藥單體紅景天苷具有極其廣泛的治療作用。在肝臟疾病治療方面，紅景天苷能保護(hù)、增強(qiáng)、恢復(fù)損傷的肝細(xì)胞，縮小局部壞死區(qū)域，抑制膠原合成或者促進(jìn)ECM的降解，表現(xiàn)出明確的抗肝纖維化作用。 （2）MSCs移植能夠在一定程度上改善肝臟功能，減少膠原的沉積，緩解或逆轉(zhuǎn)肝纖維化狀態(tài)。