表達草酸分解基因的成人骨髓間充質(zhì)干細胞體外誘導分化為肝細胞的實驗研究.pdf

1、背景:原發(fā)性高草酸尿癥（Primary Hyperoxalurias，PHs）是由于肝臟特異性酶缺乏引起機體草酸代謝障礙，草酸在體內(nèi)大量生成，從而引起一系列臨床癥狀的先天性疾病。臨床上PHs患者通常表現(xiàn)為反復發(fā)生腎結石、腎鈣質(zhì)沉著癥和腎衰竭。肝移植和肝腎聯(lián)合移植目前仍然是I型PHs的主要治療手段。但可供移植的肝來源少、移植手術難度大、手術風險及術后并發(fā)癥發(fā)生率高一定程度上限制了手術的應用。細胞移植對機體的影響相比器官移植要小得多。肝細胞

2、移植的發(fā)展有望在未來成為治療PHs的主要手段。由于人類成熟肝細胞很難在體外大量的增殖、生存期短且快速細胞表型去分化，因此獲得足夠數(shù)量可代謝草酸的肝細胞及可靠的肝細胞來源是首要問題。產(chǎn)甲酸草酸桿菌（Oxalobacter fomigenes，Ox.F）是一類可分解草酸的微生物，其降解草酸的過程主要由FCoAT和OCoAD兩種關鍵酶參與，分別由frc和oxc基因編碼。人骨髓間充質(zhì)干細胞（Human mesenchymal stem cell

3、s，hMSCs）具有向不同組織細胞分化的潛能，在體外經(jīng)特定條件下可向肝細胞分化。越來越多證據(jù)表明hMSCs有望替代肝細胞成為肝細胞移植的種子細胞。根據(jù)hMSCs的特點，本課題在前期實驗中選用了hMSCs細胞作為實驗的種子細胞，通過基因工程技術將從Ox.F中分離出來的草酸分解基因frc和oxc導入hMSCs并在細胞中成功表達，并在體外實驗證實了轉染了目的基因的hMSCs（hMSCs-frc-oxc）具備有降解草酸的功能。本實驗擬進一步證實

4、hMSCs-frc-oxc可向肝細胞分化，分化為肝細胞后該細胞仍具備降解草酸的功能。
　　目的：本實驗體外培養(yǎng)轉染了Ox.F草酸分解基因frc和oxc的hMSCs（hMSCs-frc-oxc）并誘導其向肝細胞分化，并在分化成功后檢測分化為肝細胞后的細胞代謝草酸的能力。從而獲得大量可降解草酸的肝細胞，為肝細胞移植治療PHs尋找可靠的細胞來源。為hMSCs作為種子細胞治療PHs的可行性提供實驗依據(jù)。
　　材料和方法體外培養(yǎng)P4代

5、hMSCs-frc-oxc，通過含40ug/L肝細胞生長因子（HGF）+10ug/L成纖維細胞生長因子4（FGF-4）所組成的培養(yǎng)液誘導其向肝細胞分化。分化過程中通過觀察不同時間段細胞形態(tài)學變化。在分化第14天，第28天分別行實時定量聚合酶鏈反應（RT-PCR）、Western blot技術和免疫熒光細胞化學技術檢測不同分化時間段細胞內(nèi)的肝細胞特異性標記物(AFP、ALB、CK-18)以及草酸分解基因（frc和oxc）的表達情況。細胞成

6、功向肝細胞分化后，利用離子色譜儀檢測成功分化為肝細胞后的細胞培養(yǎng)液中草酸濃度從而判斷細胞的草酸降解功能。前期實驗轉染了空病毒載體的hMSCs（hMSCs-vector）以及人成熟肝細胞L-02分別作為陰性對照組及陽性對照組。
　　結果：hMSCs-frc-oxc可在體外成功培養(yǎng)。經(jīng)誘導培養(yǎng)液培養(yǎng)后細胞形態(tài)逐漸變短，似多角形。RT-PCR可檢測經(jīng)過誘導的hMSCs-frc-oxc可成功表達肝臟特異性標志物（ALB、AFP和CK-18

7、）和草酸分解基因（frc和oxc）。未經(jīng)誘導的hMSCs-frc-oxc和hMSCs-vector未能表達肝臟特異性標志物。hMSCs-vector（無論誘導與否）未能表達草酸分解基因frc和oxc。Western blot技術檢測hMSCs-frc-oxc在誘導第14、28d細胞中AFP、CK-18較未誘導組表達明顯增加（P<0.05），并可成功表達草酸分解基因產(chǎn)物（融合蛋白 myc-FCoAT和flag-OCoAD）。免疫熒光細胞化

8、學檢測誘導28d后hMSCs-frc-oxc可成功表達ALB，未經(jīng)誘導細胞表達則呈陰性。離子色譜儀結果顯示成功肝細胞分化后的hMSCs-frc-oxc仍具有草酸降解功能，其草酸降解能力與未經(jīng)誘導的hMSCs-frc-ocx相似。而作為對照組的hMSCs-vector和正常人成熟肝細胞L-02細胞組則幾乎無草酸降解功能。
　　結論：hMSCs-frc-oxc體外經(jīng)過一定條件下可成功向肝細胞分化，表達肝臟特異性的標記物及具有部分肝細胞