TGF-β1通過miR-155調(diào)控TP53INP1對肝癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及肝癌干細(xì)胞獲得的作用及機(jī)制研究.pdf

1、背景：原發(fā)性肝癌為全球常見的惡性腫瘤之一，由于其高侵襲性和高復(fù)發(fā)率，肝癌已經(jīng)位居世界癌癥死因的第二位。肝癌轉(zhuǎn)移是引起患者死亡的主要原因。因此，加強(qiáng)對肝癌轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究，發(fā)現(xiàn)阻止肝癌轉(zhuǎn)移的方法成為了肝癌治療的重中之重。
　　上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial–mesenchymal transition, EMT）是上皮細(xì)胞表型向間質(zhì)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的過程。很多研究已經(jīng)證實(shí)，EMT在腫瘤的發(fā)生過程中發(fā)揮了重要作用，特別是在很大程度上促進(jìn)

2、惡性腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。因此，對肝癌細(xì)胞EMT的研究為肝癌轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究提供了新的思路。
　　腫瘤干細(xì)胞（cancer stem cells, CSCs）是存在于腫瘤細(xì)胞中的一小部分細(xì)胞，它們具有自我更新、分化、致瘤等有別于普通腫瘤細(xì)胞的特殊生物學(xué)特性。很多研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤干細(xì)胞是導(dǎo)致惡性腫瘤復(fù)發(fā)、耐藥以及轉(zhuǎn)移的罪魁禍?zhǔn)住Ｒ虼?，探索腫瘤干細(xì)胞在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的作用機(jī)制，可能為肝癌的治療發(fā)現(xiàn)新的作用靶點(diǎn)。
　　MicroRNAs

3、（miRNAs）是一類長度大約19~22個核苷酸的非編碼小RNA片段，在人體的各種生命活動發(fā)揮重要作用?，F(xiàn)在普遍認(rèn)為， miRNAs在惡性腫瘤的發(fā)生過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用，它們可以發(fā)揮促癌或抑癌的作用。迄今為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)很多 miRNAs可以調(diào)控腫瘤細(xì)胞EMT和CSCs的獲得，包括miR-155。但是，miR-155在肝癌細(xì)胞EMT及干細(xì)胞表型獲得中的作用及機(jī)制還未見相關(guān)報(bào)道。因此，研究miR-155在肝癌細(xì)胞EMT及干細(xì)胞表型獲得中的

4、作用及機(jī)制，對進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)肝癌轉(zhuǎn)移的機(jī)制具有重要意義。
　　第一部分 miR-155對肝癌細(xì)胞EMT及CSCs獲得的調(diào)控作用
　　目的：
　　1.利用無血清干細(xì)胞培養(yǎng)基富集肝癌干細(xì)胞，比較miR-155在肝癌干細(xì)胞和非干性肝癌細(xì)胞中的表達(dá)差異。
　　2.探討過表達(dá)miR-155對肝癌細(xì)胞EMT及CSCs獲得的調(diào)控作用。
　　方法：
　　1.我們首先利用無血清干細(xì)胞培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng) MHCC-97H肝癌細(xì)胞

5、，連傳3代，利用流式細(xì)胞儀、qPCR檢測富集細(xì)胞球中肝癌干細(xì)胞標(biāo)志物CD90、CD133、Oct4以及miR-155的表達(dá)情況，分析miR-155與干細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)的相關(guān)性。
　　2.我們利用慢病毒載體構(gòu)建 miR-155/miR-NC穩(wěn)定過表達(dá)細(xì)胞株后，利用qPCR、Western blot檢測EMT相關(guān)基因E-cadherin、N-cadherin、vimentin的表達(dá)差異，利用transwell侵襲/遷移實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)兩組細(xì)胞侵

6、襲、遷移能力的差異；利用流式細(xì)胞儀、qPCR檢測干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物CD90、CD133、Oct4的表達(dá)差異，利用成球?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證兩組細(xì)胞成球能力的差異。
　　結(jié)果：
　　1.利用無血清培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)肝癌細(xì)胞2周后，可見大量細(xì)胞球形成；與普通培養(yǎng)基中貼壁細(xì)胞相比，細(xì)胞球中CD90、CD133、Oct4明顯高表達(dá)，并且miR-155表達(dá)也明顯高于普通貼壁細(xì)胞。
　　2.miR-155過表達(dá)明顯下調(diào)了E-cadherin的表達(dá)，而

7、上調(diào)了N-cadherin和vimentin的表達(dá)，并且增強(qiáng)了細(xì)胞的侵襲和遷移能力；同時，miR-155過表達(dá)增加了CD90+、CD133+細(xì)胞的比例，干細(xì)胞相關(guān)基因Oct4表達(dá)也明顯增加，并且顯著提高了癌細(xì)胞的成球能力。當(dāng)我們用 miR-155-inhibitor抑制穩(wěn)定過表達(dá)細(xì)胞株中的 miR-155后，結(jié)果則恰恰相反。
　　結(jié)論：miR-155在肝癌細(xì)胞EMT及CSCs的獲得過程中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。
　　第二部分

8、miR-155通過靶向TP53INP1促進(jìn)肝癌細(xì)胞EMT及干細(xì)胞表型的獲得
　　目的：
　　1.驗(yàn)證在肝癌細(xì)胞中miR-155是否能夠靶向調(diào)控基因TP53INP1的表達(dá)。
　　2.驗(yàn)證抑癌基因TP53INP1是否參與了調(diào)控肝癌細(xì)胞EMT及干細(xì)胞表型獲得。
　　3.驗(yàn)證miR-155調(diào)控肝癌細(xì)胞EMT及干細(xì)胞表型的獲得是否是通過靶向調(diào)控其靶基因TP53INP1的表達(dá)而起作用。
　　方法：
　　1.我們通

9、過轉(zhuǎn)染 miR-155 mimic過表達(dá)肝癌細(xì)胞 MHCC-97H和HepG2中的miR-155后，利用qPCR、western blot檢測TP53INP1的表達(dá)變化。
　　2.為了抑制 TP53INP1的表達(dá)，我們將 siRNA轉(zhuǎn)染入 MHCC-97H和 HepG2細(xì)胞中，利用 qPCR、western blot檢測 EMT相關(guān)標(biāo)志物E-cadherin、N-cadherin、vimentin，干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物CD90、CD1

10、33、Oct4的表達(dá)，并利用流式細(xì)胞術(shù)檢測CD90+、CD133+細(xì)胞比例的變化。
　　3.為了驗(yàn)證miR-155是通過靶向抑制TP53INP1而發(fā)揮作用的，我們將 MHCC-97H細(xì)胞分為4組，并按以下組合進(jìn)行轉(zhuǎn)染：①miR-155-inhibitor-NC+ siRNA-NC② Mir-155-inhibitor+TP53INP1-siRNA-NC③ miR-155-inhibitor-NC+ TP53INP1-siRNA④M

11、ir-155-inhibitor+TP53INP1-siRNA。利用qPCR、western blot檢測以上四組細(xì)胞中EMT相關(guān)標(biāo)志物和干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物Oct4的表達(dá)差異。
　　結(jié)果：
　　1.過表達(dá)肝癌細(xì)胞MHCC-97H和HepG2中的miR-155可以明顯抑制TP53INP1的表達(dá)變化。
　　2.抑制TP53INP1的表達(dá)后，我們發(fā)現(xiàn)EMT相關(guān)標(biāo)志物E-cadherin明顯下調(diào)，而N-cadherin和vime

12、ntin則明顯上調(diào)，肝癌干細(xì)胞標(biāo)志物CD90、CD133、Oct4的RNA水平也明顯升高，并且CD90+、CD133+細(xì)胞比例有所提高。
　　3.我們發(fā)現(xiàn)共轉(zhuǎn)染miR-155-inhibitor和TP53INP1-siRNA的細(xì)胞組， siRNA在一定程度上了減弱了 miR-155-inhibitor對肝癌干細(xì)胞標(biāo)志物Oct4及EMT的抑制。
　　結(jié)論：miR-155通過靶向抑制其靶基因 TP53INP1促進(jìn)肝癌細(xì)胞 EMT

13、及干細(xì)胞表型的獲得。
　　第三部分 TGF-β1通過miR-155下調(diào)TP53INP1對肝癌細(xì)胞EMT及CSCs獲得進(jìn)行調(diào)控
　　目的：
　　1.驗(yàn)證TGF-β1對肝癌細(xì)胞EMT及干細(xì)胞表型獲得的調(diào)控作用。
　　2.驗(yàn)證TGF-β1是否可以誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞中miR-155的表達(dá)，并驗(yàn)證TGF-β1是否可以抑制TP53INP1的表達(dá)。
　　3.驗(yàn)證TGF-β1抑制TP53INP1的表達(dá)是通過對miR-155的調(diào)控

14、而實(shí)現(xiàn)的。
　　方法：
　　1. TGF-β1加入肝癌細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段時間后，觀察細(xì)胞形態(tài)變化，利用 qPCR、western blot檢測 EMT相關(guān)標(biāo)志物 E-cadherin、N-cadherin，干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物CD90、CD133、Oct4的表達(dá)。
　　2. TGF-β1處理肝癌細(xì)胞后，用qPCR檢測miR-155和TP53INP1的表達(dá)變化。
　　3.為了驗(yàn)證TGF-β1抑制TP53INP1的表達(dá)

15、是通過對miR-155的調(diào)控而實(shí)現(xiàn)的，我們將細(xì)胞分為三組，并按以下組合處理肝癌細(xì)胞：①TGF-β1+miR-155-inhibitor②TGF-β1+miR-155-inhibitor-NC③NC。利用qPCR、western blot檢測以上三組細(xì)胞中TP53INP1的表達(dá)差異，并檢測EMT相關(guān)標(biāo)志物和干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物Oct4的表達(dá)差異。
　　結(jié)果：
　　1. TGF-β1誘導(dǎo)后，肝癌細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，EMT相關(guān)標(biāo)志物

16、E-cadherin明顯下調(diào)，而 N-cadherin則明顯上調(diào)，肝癌干細(xì)胞標(biāo)志物CD90、CD133、Oct4的RNA水平也明顯升高。
　　2. TGF-β1誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞后，我們發(fā)現(xiàn)TP53INP1表達(dá)下調(diào)，并且miR-155表達(dá)明顯上調(diào)。
　　3.我們發(fā)現(xiàn)miR-155 inhibitor不僅可以在一定程度上減弱TGF-β1對TP53INP1的抑制，而且還可以減弱TGF-β1對肝癌細(xì)胞EMT的誘導(dǎo)作用，并且 TGF-β1