IGF1通過(guò)PPARγ-Axin2-Wnt信號(hào)通路促進(jìn)內(nèi)源性脂肪干-前體細(xì)胞成脂分化.pdf

1、目的：外傷、腫瘤切除、先天性畸形等常造成機(jī)體軟組織的缺損，如何有效地修復(fù)軟組織缺損是目前組織工程領(lǐng)域的重點(diǎn)和難點(diǎn)。隨著干細(xì)胞技術(shù)的深入研究與發(fā)展，將干細(xì)胞作為種子細(xì)胞應(yīng)用于修復(fù)軟組織缺損是目前最有前景的方法。脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（adipose stem cells，ASCs）由于具有來(lái)源豐富、取材方便、培養(yǎng)簡(jiǎn)單、具有多分化潛能且無(wú)倫理學(xué)障礙等優(yōu)點(diǎn)，成為目前組織工程領(lǐng)域最受關(guān)注的種子細(xì)胞。但從脂肪組織中通過(guò)膠原酶消化、過(guò)濾、離心等步驟獲得的

2、脂肪組織來(lái)源血管基質(zhì)成分（Stromal Vascular Fraction，SVF），并不是單純的ASCs，而是一群混合細(xì)胞群體，經(jīng)過(guò)2-3次的消化傳代能得到一定的純化，目前用于基礎(chǔ)及臨床研究的大部分都是這種非完全純化的細(xì)胞。近年來(lái)，關(guān)于ASCs在脂肪組織中的原位起源（In Situ location）及SVF中亞細(xì)胞群的多向分化的報(bào)道增加。然而由于間充質(zhì)干細(xì)胞沒(méi)有特異的表面標(biāo)志，到目前為止，關(guān)于ASCs在脂肪組織中的原位定位尚未確切

3、定論。研究這一問(wèn)題對(duì)于更好地將ASCs用于軟組織修復(fù)至關(guān)重要。
　　大量研究表明，脂肪細(xì)胞分化是一個(gè)受多種轉(zhuǎn)錄因子、生長(zhǎng)因子及信號(hào)通路調(diào)控的非常精細(xì)且復(fù)雜的過(guò)程。其中轉(zhuǎn)錄因子過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體-γ（PPARγ）在這一過(guò)程中起著關(guān)鍵的開(kāi)啟作用，它對(duì)體內(nèi)脂肪組織的形成是必須的，敲除3T3-L1細(xì)胞中的PPARγ基因會(huì)導(dǎo)致其喪失成脂分化能力，而且缺乏PPARγ基因的小鼠胚胎也不能形成脂肪組織。Wnt信號(hào)通路是對(duì)細(xì)胞增殖以及間充質(zhì)

4、干細(xì)胞的成骨、成脂分化平衡起調(diào)控作用的重要通路，PPARγ能否通過(guò)調(diào)控Wnt信號(hào)通路來(lái)促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化以及如何調(diào)控Wnt信號(hào)通路，目前尚不清楚。另外，胰島素/胰島素生長(zhǎng)因子-1（Insulin-like growth factor-1，IGF1）也是成脂分化過(guò)程必不可少的，雖然有文獻(xiàn)報(bào)道IGF1與靶細(xì)胞膜上的特異性受體結(jié)合以后，能促進(jìn)靶細(xì)胞的增殖和成脂分化，但對(duì)于IGF1在促進(jìn)成脂分化過(guò)程中是否能影響 Wnt信號(hào)通路及周圍靶細(xì)胞，尚無(wú)相

5、關(guān)報(bào)道。對(duì)這些問(wèn)題的探討有助于更有效地將IGF1應(yīng)用于脂肪組織再生。
　　本研究流式分選出SVF中的亞細(xì)胞群CD31-/CD34+/CD146+及CD31-/CD34+/CD146-，擬通過(guò)比較這兩亞細(xì)胞群的體外增殖、成脂成骨分化能力及潛在的機(jī)制研究，尋找到具有更強(qiáng)成脂能力的種子細(xì)胞。同時(shí)，通過(guò)IGF1促進(jìn)成脂的機(jī)制及應(yīng)用研究，找到更有效的脂肪組織再生新方法。研究分為三個(gè)部分：不同細(xì)胞亞群體外增殖、多向分化能力的比較；PPARγ-

6、Axin2-Wnt信號(hào)通路在成脂分化過(guò)程中的機(jī)制研究；IGF1對(duì)Wnt信號(hào)通路和SVF中亞細(xì)胞群的影響，以及在促進(jìn)脂肪再生中的應(yīng)用研究。
　　方法：(1)將新鮮的人脂肪組織做冰凍切片，免疫熒光檢測(cè) CD31、CD34、CD146在脂肪組織中的分布情況。分離培養(yǎng)脂肪組織來(lái)源的SVF，通過(guò)流式細(xì)胞儀分選，將細(xì)胞分為CD31-/CD34+/CD146+和CD31-/CD34+/CD146-亞群，重點(diǎn)分析兩亞群在SVF中所占的比例，比較兩

7、者的增殖、成脂成骨分化能力，檢測(cè)分化相關(guān)基因的表達(dá)。
　　(2)比較對(duì)細(xì)胞的增殖及成脂成骨分化能力有重要調(diào)控作用的Wnt/β-catenin信號(hào)通路在細(xì)胞亞群中的強(qiáng)弱。檢測(cè)亞群細(xì)胞中PPARγ與Wnt對(duì)彼此的調(diào)控，并進(jìn)一步檢測(cè)PPARγ與Wnt信號(hào)通路抑制劑Axin2的關(guān)系。過(guò)表達(dá)或干擾PPARγ表達(dá)后，檢測(cè)Axin2的基因表達(dá)。Axin2的啟動(dòng)子上有PPARγ的結(jié)合位點(diǎn)，通過(guò)免疫熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)分析此結(jié)合位點(diǎn)存在及切除后，轉(zhuǎn)染P

8、PARγ對(duì)Axin2表達(dá)的影響。并檢測(cè)干擾Axin2對(duì)ASCs成脂分化的影響。
　　(3)體外檢測(cè)IGF1對(duì)ASCs增殖、遷移及成脂分化的影響，分析用IGF1處理后的ASCs中CD31-/CD34+/CD146+和CD31-/CD34+/CD146-比例的變化，并檢測(cè)IGF1對(duì)CD31-/CD34+/CD146+和CD31-/CD34+/CD146-亞群細(xì)胞的增殖、成脂分化及Wnt活性的影響。用微球作為IGF1的緩釋載體，將含有微

9、球的PLGA支架材料移植入C57B16小鼠腹股溝的脂肪墊處，4周后檢測(cè)支架中脂肪組織生長(zhǎng)情況。
　　結(jié)果：(1)免疫熒光結(jié)果顯示，CD34+的細(xì)胞主要分布在脂肪組織的血管周圍；CD146+的細(xì)胞在血管壁上以及廣泛地分布于脂肪周圍結(jié)締組織中，在血管周圍存在CD34與CD146的共定位；CD31+的細(xì)胞主要分布在血管腔內(nèi)，有少量與CD146共定位，故在脂肪組織的血管周圍確實(shí)存在兩群細(xì)胞CD31-/CD34+/CD146+和CD31-/

10、CD34+/CD146-。流式結(jié)果顯示第一代的SVF中 CD31-/CD34+/CD146+的比例明顯高于CD31-/CD34+/CD146-，兩亞群在SVF中的比例都會(huì)隨著細(xì)胞傳代而降低，但在CD31-/CD34+的細(xì)胞中，CD146-的比例下降，CD146+的比例升高。
　　(2)兩細(xì)胞亞群相比較，CD31-/CD34+/CD146+細(xì)胞的增殖能力強(qiáng)于CD31-/CD34+/CD146-，但CD31-/CD34+/CD146-

11、具有很強(qiáng)大的成脂分化能力，而成骨分化能力較弱。成脂分化轉(zhuǎn)錄因子 PPARγ、脂肪酸結(jié)合蛋白4（FABP4）及成骨分化相關(guān)基因Runx2、OCN、CollagenⅠ的表達(dá)也證實(shí)了這一現(xiàn)象。對(duì)細(xì)胞增殖和多向分化有重要調(diào)控作用的Wnt/β-catenin信號(hào)通路在CD31-/CD34+/CD146+細(xì)胞中有更強(qiáng)的活性。
　　(3)成脂分化過(guò)程中，轉(zhuǎn)錄因子PPARγ與Wnt信號(hào)通路之間有負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用，而與Wnt信號(hào)通路的抑制劑Axin2

12、存在高度的線性相關(guān)。染色質(zhì)免疫共沉淀等檢測(cè)發(fā)現(xiàn)PPARγ能直接調(diào)控Axin2的表達(dá)。這些結(jié)果表明PPARγ通過(guò)促進(jìn)Axin2的表達(dá)來(lái)下調(diào)Wnt信號(hào)通路，從而促進(jìn)ASCs的成脂分化。
　　(4)IGF1能誘導(dǎo)CD31-/CD34+/CD146+向CD31-/CD34+/CD146-細(xì)胞轉(zhuǎn)化，且能促進(jìn)兩細(xì)胞亞群及SVF的增殖、遷移、成脂分化。通過(guò)PLGA支架材料將IGF1移植到小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)IGF1能誘導(dǎo)宿主脂肪組織中的ASCs的歸巢

13、，促進(jìn)局部的脂肪組織再生。
　　結(jié)論：尋找最佳的種子細(xì)胞是干細(xì)胞在組織工程領(lǐng)域應(yīng)用需要解決的關(guān)鍵問(wèn)題之一。SVF中的CD31-/CD34+/CD146-具有更強(qiáng)的成脂分化能力，PPARγ-Axin2-Wnt信號(hào)通路在其中起著非常關(guān)鍵的作用，PPARγ能通過(guò)促進(jìn)Axin2的表達(dá)來(lái)下調(diào)Wnt信號(hào)通路，從而促進(jìn)ASCs的體外成脂分化；而IGF1能誘導(dǎo)CD31-/CD34+/CD146+向CD31-/CD34+/CD146-細(xì)胞轉(zhuǎn)化，且能