硅酸二鈣涂層離子溶液促進人骨髓間充質干細胞成骨分化及其機制的實驗研究.pdf

1、第一部分人骨髓間充質干細胞的分離、培養(yǎng)及鑒定
　　 目的:從人骨髓中分離培養(yǎng)hMSCs并對其細胞生物學特性進行觀察。
　　 方法:無菌條件下在健康志愿者髂棘處穿刺抽取骨髓，運用密度梯度離心法分離骨髓單個核細胞，培養(yǎng)在含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，再利用貼壁篩選法純化獲得人骨髓間充質干細胞，對其進行細胞生長和形態(tài)學的觀察，流式細胞儀檢測第3代hMSCs細胞表面標志并分析細胞周期。
　　 結果:所分離培養(yǎng)出的細

2、胞形態(tài)呈長梭形，漩渦狀生長，純度隨傳代次數增加而提高，8代以后細胞擴增速度變慢，細胞形態(tài)也發(fā)生改變。P3代骨髓間充質干細胞的表面標志CD90、CD105表達強陽性，而CD34、CD11b陰性。第1、3、5代hMSCs生長曲線呈S形，無顯著性差異，均經歷潛伏期、對數增殖期和停滯期三個時期。培養(yǎng)的第3代骨髓間充質干細胞中處于G0/G1期的細胞比例約為77.42％，處于S+G2/M期的細胞比例為22.58％左右。
　　 結論:采用密度

3、梯度離心結合貼壁篩選培養(yǎng)法可獲得純度較高且增殖活性強的人骨髓間充質干細胞，是一種簡單、經濟、有效的分離純化骨髓間充質干細胞的方法。
　　 第二部分硅酸二鈣涂層離子溶液對人骨髓間充質干細胞增殖及凋亡的影響
　　 目的:通過硅酸二鈣涂層離子溶液與人骨髓間充質干細胞復合培養(yǎng)，試圖闡明硅酸二鈣涂層離子溶液對人骨髓間充質干細胞增殖、細胞周期及凋亡的影響。
　　 方法:將等離子噴涂的硅酸二鈣涂層鈦片浸泡在DMEM培養(yǎng)基中，3

4、7℃下靜置72小時，電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜儀(ICP)測定培養(yǎng)基中Si、Ca、P離子濃度的變化。骨髓間充質干細胞分別培養(yǎng)在四種培養(yǎng)基(OS-DS-、OS-DS+、OS+DS-、OS+DS+)中，MTT法測定細胞增殖情況，流式細胞儀檢測hMSCs位于G0/G1、S、G2/M期的細胞數及增殖指數、細胞凋亡率。
　　 結果:與OS-DS-培養(yǎng)基相比，OS-DS+、OS+DS+培養(yǎng)基中Si離子濃度顯著升高(P<0.05)；OS-D

5、S+、OS+DS-和OS+DS+培養(yǎng)基中Ca離子濃度略有下降，但沒有統(tǒng)計學差異；OS+DS-、OS+DS+培養(yǎng)基中P離子濃度明顯增高。在培養(yǎng)的1-4天，OS-DS+和OS+DS+組細胞增殖率高于OS-DS-組，并分別在第2、3天時差異具有統(tǒng)計學意義；OS+DS-組的細胞數始終低于OS-DS-組，在第7天時有顯著性差異(P<0.05)。流式細胞儀測定結果顯示，在第4天時，OS-DS+和OS+DS+組處于G0/G1期的細胞比例明顯低于OS-

6、DS-組，G2/M期細胞比例明顯高于OS-DS-組(P<0.05)；OS+DS-組處于S期的細胞數在第4天時比OS-DS-組明顯減少，而OS+DS+和OS-DS+組S期的細胞比例分別在第4、14天明顯高于OS-DS-組。和OS-DS-組比較，OS+DS-和OS+DS+組細胞凋亡率在第7、14天顯著增高，而OS-DS+組細胞凋亡率在第14天明顯高于OS-DS-組(P<0.05)。
　　 結論:硅酸二鈣涂層離子溶液能促進人骨髓間充質

7、干細胞的早期增殖，其促細胞增殖的能力可能與培養(yǎng)基中較高的硅離子濃度有關，通過加速骨髓間充質干細胞周期的轉換而達到的。
　　 第三部分硅酸二鈣涂層離子溶液促進人骨髓間充質干細胞成骨分化的研究
　　 目的:通過檢測骨髓間充質干細胞成骨分化過程中特異性基因的表達，探討硅酸二鈣涂層離子溶液對骨髓間充質干細胞成骨分化的影響。
　　 方法:人骨髓間充質干細胞分別培養(yǎng)在四種培養(yǎng)基(OS-DS-、OS-DS+、OS+DS-、OS

8、+DS+)中，采用對硝基苯磷酸鹽法測定細胞內堿性磷酸酶(ALP)活性，茜素紅S染色方法觀察鈣化結節(jié)的形成，以半定量RT-PCR檢測轉錄因子Runx2、Ⅰ型膠原、骨結合素及骨鈣素的基因表達情況。
　　 結果:在整個培養(yǎng)過程中OS+DS-、OS+DS+組ALP活性顯著高于OS-DS-和OS-DS+組；在第7、14和21天時，OS+DS+組細胞內ALP活性明顯高于OS+DS-組；從第7天起，OS-DS+組ALP活性高于OS-DS-組，

9、并于第14天時差異具有統(tǒng)計學意義。在培養(yǎng)的第14天，OS-DS+、OS+DS-和OS+DS+組鈣沉積的OD值均高于OS-DS-組，有顯著性差異(P<0.05)；與OS+DS-組相比，OS+DS+組鈣沉積的OD值明顯增高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。培養(yǎng)28天后，OS+DS+組鈣化結節(jié)的數量和著色程度均較OS+DS-組明顯增加，其他兩組未見鈣化結節(jié)形成。在第4、7、14天時，成骨誘導組hMSCs成骨分化相關標志基因的表達量顯著高于

10、非成骨誘導組；OS-DS+組Runx2與骨結合素mRNA表達水平分別在第7、14天明顯高于OS-DS-組；在第14天，OS+DS+組各特異性基因的表達量均顯著高于OS+DS-組。
　　 結論:硅酸二鈣涂層離子溶液自身能夠在一定程度上誘導骨髓間充質干細胞向成骨細胞分化；和成骨誘導劑協(xié)同，則促進鈣沉積及骨髓間充質干細胞的成骨分化。
　　 第四部分硅酸二鈣涂層離子溶液促進人骨髓間充質干細胞成骨分化機制的研究
　　 目的

11、:探討硅酸二鈣涂層離子溶液促進人骨髓間充質干細胞成骨分化的可能分子機制。
　　 方法:骨髓間充質干細胞分別培養(yǎng)在三組培養(yǎng)基(OS+DS-、OS+DS+、OS+DS+/PD)中，以Western blot方法檢測細胞內ERK的磷酸化表達情況；加入ERK特異性抑制劑PD98059后，分別采用對硝基苯磷酸鹽法、茜素紅S染色方法測定堿性磷酸酶活性與鈣沉積變化。
　　 結果:與OS+DS-組相比，在第7、14及21天，OS+DS+

12、組細胞內堿性磷酸酶活性顯著增加(P<0.05)，其作用可被ERK途徑抑制劑PD98059阻斷(P<0.01)。OS+DS+組鈣沉積在第14天時明顯高于OS+DS-組(P<0.05)，其作用也可被PD98059抑制，差異具有統(tǒng)計學意義。hMSCs受到OS+DS+培養(yǎng)基作用后10 min，細胞中磷酸化的ERK表達顯著增強(P<0.01)，并維持在較高水平至60min，隨后磷酸化的ERK表達逐漸降低到基線水平。比較三組培養(yǎng)基作用10 min后