骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植在腦復(fù)蘇治療中應(yīng)用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、心搏驟停(CA)導(dǎo)致極高的致死、致殘率，已成為威脅人類健康的重要因素。近年來隨著急救網(wǎng)絡(luò)完善，急救技術(shù)進(jìn)步，心搏驟?；颊呋謴?fù)自主循環(huán)的機(jī)會增加，但絕大多數(shù)自主循環(huán)恢復(fù)(ROSC)的患者卻隨后因腦功能損害而死亡或殘留神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥。如何有效地實(shí)施腦復(fù)蘇治療挽救缺血神經(jīng)元，促進(jìn)受損神經(jīng)組織修復(fù)以盡可能維持正常的神經(jīng)功能已成為心肺復(fù)蘇的重點(diǎn)，也是目前急救醫(yī)學(xué)面臨的難題。長期以來，腦復(fù)蘇藥物治療的研究進(jìn)展不大，低溫治療雖具有一定的腦保護(hù)作用，但

2、難以逆轉(zhuǎn)已形成的神經(jīng)損害，因而有待新的治療措施出現(xiàn)以提高腦復(fù)蘇的治療效率。
　　 干細(xì)胞移植是近幾年興起的治療手段，在此前腦梗塞的實(shí)驗(yàn)研究中，以骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)為主的干細(xì)胞治療取得了令人矚目的進(jìn)展，研究表明MSCs移植后減輕了局灶性缺血導(dǎo)致的神經(jīng)元損傷，減少了梗死面積，并促進(jìn)了神經(jīng)功能恢復(fù)，提示MSCs移植可能在腦復(fù)蘇治療中具有一定的應(yīng)用前景。目前尚未有干細(xì)胞移植應(yīng)用于腦復(fù)蘇治療的研究報道，而全腦缺血損害發(fā)病機(jī)制、缺

3、血損傷范圍、性質(zhì)都有別于局灶性腦梗死，因此MSCs移植后如何在腦組織內(nèi)分布和分化，是否能減輕全腦缺血損傷尚不得而知。
　　 本研究探討MSCs移植對心搏驟停后全腦缺血損傷的治療作用以探索新的腦復(fù)蘇治療途徑。主要內(nèi)容包括:建立大鼠MSCs培養(yǎng)和擴(kuò)增方法，體外驗(yàn)證MSCs向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化的能力；建立大鼠腦復(fù)蘇模型；增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)標(biāo)記MSCs，觀察EGFP-MSCs移植對全腦缺血損傷的治療作用以及移植細(xì)胞在腦內(nèi)分布和

4、分化情況；進(jìn)一步利用磁共振成像(MRI)技術(shù)活體示蹤移植的MSCs。
　　 第一部分大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)及向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化的研究
　　 研究目的:建立大鼠骨髓MSCs的體外培養(yǎng)方法，研究MSCs的生物學(xué)特性。驗(yàn)證MSCs在體外向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化的能力。為MSCs移植在腦復(fù)蘇治療中應(yīng)用的研究提供實(shí)驗(yàn)和理論基礎(chǔ)。
　　 材料和方法:細(xì)胞培養(yǎng)健康4～5周齡Sprague-Dawley(SD)大鼠，無菌條件下抽

5、取骨髓，用貼壁培養(yǎng)法分離骨髓MSCs，在37℃、50％CO2、飽和濕度的條件下，以含有10％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)，24h半量換液，3d全量換液。7～9天細(xì)胞鋪滿瓶底后第一次傳代，此后在細(xì)胞生長至約90％融合時進(jìn)行傳代。
　　 MSCs生物學(xué)特性培養(yǎng)過程中觀察細(xì)胞形態(tài)，以MTT法測定細(xì)胞生長曲線，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期和細(xì)胞表面抗原CD45、CD11b、CD29、CD44表達(dá)情況。
　　 誘導(dǎo)MSCs向神經(jīng)

6、元樣細(xì)胞分化以丹參和β-巰基乙醇(β-ME)進(jìn)行誘導(dǎo)，選擇生長狀態(tài)良好的第3代的MSCs，按2x105/孔密度接種6孔板，加入丹參和β-ME預(yù)誘導(dǎo)液培育24h，更換培養(yǎng)液，PBS洗滌3次，分別加入丹參和β-ME誘導(dǎo)液誘導(dǎo)5h。觀察誘導(dǎo)后細(xì)胞形態(tài)變化，采用RT-PCR和免疫熒光技術(shù)檢測星形膠質(zhì)細(xì)胞酸性蛋白(GFAP)和微管相關(guān)蛋白-2(MAP-2)的mRNA和蛋白表達(dá)情況。
　　 結(jié)論:
　　 1.建立了MSCs原代培養(yǎng)和

7、體外擴(kuò)增的實(shí)驗(yàn)方法；
　　 2.MSCs取材方便，增殖活性高，體外培養(yǎng)易于擴(kuò)增、純化，符合干細(xì)胞移植研究的需要；
　　 3.β-巰基乙醇和丹參等誘導(dǎo)劑可在體外誘導(dǎo)MSCs分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞。
　　 第二部分大鼠心搏驟停和復(fù)蘇裝置研發(fā)和腦復(fù)蘇模型的建立
　　 研究目的:研發(fā)大鼠心搏驟停和復(fù)蘇裝置(包括電刺激致顫器和機(jī)械復(fù)蘇裝置)，掌握利用該裝置建立標(biāo)準(zhǔn)復(fù)蘇模型的技術(shù)參數(shù)和實(shí)驗(yàn)條件；研究建立腦復(fù)蘇模型的合適缺

8、血時間；探討MR檢測在評價全腦缺血損傷中的應(yīng)用價值。
　　 材料和方法:心搏驟停和復(fù)蘇裝置研發(fā)和復(fù)蘇模型研究研發(fā)用于大鼠交流電致顫器和機(jī)械復(fù)蘇裝置。選用SD雄性大鼠20只，應(yīng)用研發(fā)的心搏驟停和復(fù)蘇機(jī)械裝置，持續(xù)交流電經(jīng)右心室內(nèi)膜致顫。在6min心室顫動后，開始給予6min的機(jī)械胸外按壓和同步機(jī)械通氣，隨后雙向波經(jīng)胸體外除顫。
　　 腦復(fù)蘇模型合適缺血時間的研究實(shí)驗(yàn)分組:(1)對照組，進(jìn)行手術(shù)操作，不致顫和復(fù)蘇；(2)VF

9、6組，無處理室顫6min，復(fù)蘇6min；(3)VF8組，無處理室顫8min，復(fù)蘇6min；(3)VF10組，無處理室顫10min，復(fù)蘇6min；實(shí)驗(yàn)組大鼠在ROSC后1d、3d、7d、14d分別進(jìn)行腦組織病理以及含水量檢測和NSS神經(jīng)功能評分。對照組在手術(shù)完成后24h進(jìn)行上述檢測和評分。
　　 MR評價全腦缺血損傷的研究實(shí)驗(yàn)組于ROSC后上述時間點(diǎn)再次麻醉動物進(jìn)行MR檢測。對照組3只大鼠在完成手術(shù)操作后3d進(jìn)行MR檢測。MR檢測

10、序列包括SET1WI、T2WI，T1WI:TR350ms，TE18ms，T2WI:TR1600ms，TE80ms，矩陣256×256，層厚2mm，視野7cm×7cm，線圈11cm。
　　 結(jié)論:
　　 1.研制成功大鼠交流電致顫器和機(jī)械心肺復(fù)蘇裝置。該裝置符合心肺腦復(fù)蘇實(shí)
　　 驗(yàn)研究的要求；
　　 2.CPP維持在25mmHg左右是復(fù)蘇成功的條件；
　　 3.未處理室顫8min和心肺復(fù)蘇6min

11、是較為合適的腦復(fù)蘇模型缺血時間；
　　 4.心搏驟停后全腦缺血損傷具有部位選擇性和延后性特點(diǎn)；
　　 5.MR檢查可以應(yīng)用于評價全腦缺血損傷。
　　 第三部分MsCs移植應(yīng)用于腦復(fù)蘇治療的研究
　　 研究目的:研究通過腺病毒載體(Ad5F35)轉(zhuǎn)導(dǎo)外源基因增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)體外標(biāo)記MSCs的有效性和安全性；以大鼠腦復(fù)蘇模型為研究對象，通過頸動脈移植EGFP-MSCs，觀察EGFP-MSCs是否

12、進(jìn)入全腦缺血損傷腦組織，能否分化為神經(jīng)細(xì)胞；通過病理組織檢測、腦組織含水量測定和神經(jīng)功能評分評價MSCs移植對全腦缺血損傷的治療作用。
　　 材料和方法:EGFP體外標(biāo)記MSCs通過腺病毒載體Ad5F35將EGFP基因轉(zhuǎn)染MSCs，以流式細(xì)胞儀和熒光顯微鏡觀察評價不同條件下的轉(zhuǎn)染率；觀察轉(zhuǎn)染后EGFP-MSCs的細(xì)胞活力、凋亡率、細(xì)胞周期以及向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化能力。
　　 MSCs移植治療全腦缺血損傷的研究(1)分組設(shè)計

13、:按前述方法建立大鼠腦復(fù)蘇模型，大鼠經(jīng)歷8分鐘無處理室顫和6分鐘心肺復(fù)蘇，ROSC后進(jìn)行右頸動脈置管，將大鼠隨機(jī)分為兩組:PBS組和:EGFP-MSCs組，分別于ROSC后2h由右頸動脈輸入5×106EGFP-MSCs或0.5mlPBS每組納入實(shí)驗(yàn)動物數(shù)為24只。(2)治療作用評價:在大鼠自主循環(huán)恢復(fù)后1d、3d、7d、14d以NSS評分評價大鼠神經(jīng)功能，并進(jìn)行腦組織病理和含水量檢測。
　　 MSCs移植后在腦組織分布和分化情況

14、制備腦組織冰凍切片，熒光顯微鏡下觀察熒光細(xì)胞分布情況，同時采用免疫熒光檢測MAP-2、GFAP表達(dá)情況。
　　 結(jié)論:
　　 1.通過腺病毒載體Ad5F35轉(zhuǎn)染EGFP，可以高效、穩(wěn)定、安全地標(biāo)記MSCs；
　　 2.MSCs移植可進(jìn)入全腦缺血損傷腦組織內(nèi)，并部分分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞；
　　 3.MSCs移植可減輕全腦缺血腦組織損傷，改善神經(jīng)功能，促進(jìn)腦組織水腫消退。
　　 第四部分MSCs

15、菲立磁標(biāo)記及MR活體示蹤的研究
　　 研究目的:研究通過硫酸魚精蛋白為載體將菲立磁轉(zhuǎn)入MSCs，對MSCs進(jìn)行磁性標(biāo)記的可行性和安全性；在腦復(fù)蘇模型中探討以MR活體示蹤移植的磁性標(biāo)記MSCs的可行性；以MR活體示蹤技術(shù)研究MSCs移植后在全腦缺血損傷腦內(nèi)分布和遷移規(guī)律。
　　 材料和方法:菲立磁標(biāo)記 MSCs的體外實(shí)驗(yàn)(1)以硫酸魚精蛋白為載體將10μg/mL、20μg/mL、50μg/mL、100μg/mL不同劑量菲立

16、磁轉(zhuǎn)入MSCs，以電鏡檢查和普魯士藍(lán)染色進(jìn)行標(biāo)記后鑒定和標(biāo)記率分析；(2)對磁性標(biāo)記后的MSCs作MR體外成像研究；(3)觀察磁性標(biāo)記對MSCs細(xì)胞形態(tài)、增殖活性、凋亡率影響。
　　 磁標(biāo)記MSCs移植后MR活體示蹤的研究(1)分組設(shè)計:假手術(shù)組(n=3)在手術(shù)操作完成后不進(jìn)行心搏驟停和心肺復(fù)蘇，手術(shù)操作完成后4h經(jīng)右頸動脈輸入5×106磁性(FE-PRO)標(biāo)記MSCs；大鼠.ROSC后隨機(jī)分為兩組:FE-PRO標(biāo)記MSCs組和

17、單純MSCs組，分別在大鼠ROSC后2h經(jīng)右頸動脈輸入5×106魚精蛋白-菲立磁(FE-PRO)標(biāo)記MSCs或未標(biāo)記MSCs。(2):MR檢測:在輸入細(xì)胞后1d、3d、7d、14d再次麻醉大鼠進(jìn)行MR檢測，各時間點(diǎn)各3只動物。檢測部位包括腦、肝臟、脾臟、股骨骨髓腔，檢測序列均為SET1WI，SET2WI。(3)組織普魯士藍(lán)染色在各時間點(diǎn)進(jìn)行完MR檢測后，取腦、肝臟、脾臟、肺臟多聚甲醛固定，石臘包埋，切片，普魯士藍(lán)染色30min，隨后核固