血管緊張素Ⅱ聯(lián)合5-氮雜胞苷對(duì)小鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞向心肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞分化的影響.pdf

1、背景與目的:
　　心肌一旦發(fā)生梗死，很難通過心肌再生恢復(fù)心肌功能。脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(Adipose-derived mesenchymalstemcells，ADMSCs)由于其獨(dú)特的優(yōu)勢成為細(xì)胞心肌成形術(shù)中理想的種子細(xì)胞。目前對(duì)ADMSCs分化為心肌血管內(nèi)皮細(xì)胞的研究較少。本研究利用血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)和5-氮雜胞苷(5-aza)聯(lián)合誘導(dǎo)小鼠ADMSCs向心肌細(xì)胞分化的同時(shí)，觀察對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞分化的影響，試圖為臨床上尋找更合理的

2、治療缺血性心臟病的方法提供實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。
　　方法:
　　1.ADMSCs的體外分離與培養(yǎng):取小鼠腹股溝脂肪，利用差速貼壁法進(jìn)行分離純化，并進(jìn)行傳代。觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)，運(yùn)用MTT法檢測細(xì)胞的增殖情況，運(yùn)用免疫熒光技術(shù)檢測細(xì)胞表面抗原CD90，CD105，CD73，CD45的表達(dá)。
　　2.實(shí)驗(yàn)分組:將細(xì)胞分為4組:(1)對(duì)照組:加完全培養(yǎng)基的ADMSCs。(2)5-aza組:加含有5-aza培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)24h，

3、然后更換為完全培養(yǎng)基。(3) AngⅡ組:加含有AngⅡ培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)24h，然后更換為完全培養(yǎng)基。(4)聯(lián)合誘導(dǎo)組:加入含有5-aza和AngⅡ的培養(yǎng)基誘導(dǎo)24h，然后更換為完全培養(yǎng)基。
　　3.光鏡下觀察經(jīng)誘導(dǎo)后的細(xì)胞形態(tài)學(xué)特點(diǎn)。運(yùn)用免疫熒光鑒定CD31，cTnT的表達(dá)，運(yùn)用Western blot檢測cTnT蛋白含量。
　　結(jié)果：
　　1.形態(tài)學(xué)特點(diǎn):原代ADMSCs胞核較小，形態(tài)多樣，短梭形，橢圓形、不規(guī)則形，

4、胞體兩端有長、短不一的突出。第3代的細(xì)胞體積增大，形態(tài)趨于一致，排列規(guī)則。經(jīng)5-aza誘導(dǎo)后的細(xì)胞形態(tài)多樣化，有短桿狀、不規(guī)則形狀，部分包膜不清晰，胞質(zhì)中出現(xiàn)空泡;經(jīng)AngⅡ及聯(lián)合培養(yǎng)組誘導(dǎo)的細(xì)胞，增殖速度較快，細(xì)胞形態(tài)均勻，包膜清晰，分泌基質(zhì)較多，呈集團(tuán)狀聚集，部分細(xì)胞形成環(huán)狀分布。
　　2.MTT法結(jié)果顯示:ADMSCs生長曲線呈“S”形，第1-3天為細(xì)胞生長潛伏期，第4天開始進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期，第7天達(dá)高峰期。
　　3.免

5、疫熒光檢測結(jié)果:第3代ADMSCs表面CD90、CD105、CD73陽性表達(dá)，CD45陰性表達(dá)。AngⅡ組，聯(lián)合誘導(dǎo)組均能表達(dá)CD31。5-aza組、AngⅡ組，聯(lián)合誘導(dǎo)組均能表達(dá)cTnT。
　　4.Western blotting結(jié)果:5-aza組、AngⅡ組，聯(lián)合誘導(dǎo)組均能表達(dá)cTnT，且聯(lián)合誘導(dǎo)組的cTnT蛋白表達(dá)量最高。
　　結(jié)論：
　　1.5-aza和AngⅡ在體外均能夠誘導(dǎo)ADMSCs分化為心肌細(xì)胞，兩者聯(lián)