TH基因轉(zhuǎn)染的骨髓源性神經(jīng)干細(xì)胞在不同移植途徑下對PD大鼠模型治療作用的實驗研究.pdf

1、帕金森病是一種以錐體外系黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元進行性損害為主要病理表現(xiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退變性疾病。其病因及發(fā)病機制尚不能夠確定，而且目前的內(nèi)、外科治療只限于對患者癥狀的控制，不能阻止其病程的進展。近年來，隨著神經(jīng)干細(xì)胞研究的深入以及基因工程技術(shù)的日臻完善，使神經(jīng)干細(xì)胞的基因方法治療帕金森病成為可能。 目前已經(jīng)明確，人腦內(nèi)多巴胺含量約90％左右集中于中腦，尤其是黑質(zhì)-紋狀體區(qū)，當(dāng)此處DA含量下降超過70％時，患者將開始出現(xiàn)PD的臨床表現(xiàn)

2、，而DA在腦內(nèi)生成代謝過程中，中腦內(nèi)酪氨酸羥化酶起到關(guān)鍵作用，是DA生成的限速酶。研究顯示：PD患者腦內(nèi)TH及THmRNA的含量是同步降低的，而補充中腦TH，可以提高腦內(nèi)DA含量，并可以改善PD癥狀。因此，在PD基因治療中TH基因自然成為治療基因的首選。 干細(xì)胞是一類可以在體內(nèi)和體外大量自我復(fù)制、并能夠持續(xù)保持不對稱分裂特性的細(xì)胞群，包括胚胎干細(xì)胞、成體干細(xì)胞及骨髓源性干細(xì)胞等。在干細(xì)胞移植治療PD的實驗中，各種干細(xì)胞均收到良好

3、的治療效果，但是由于胚胎干細(xì)胞、成體干細(xì)胞受到來源少、操作復(fù)雜及倫理道德等限制，使骨髓源性干細(xì)胞成為目前研究的熱點。骨髓基質(zhì)干細(xì)胞是骨髓中除去造血干細(xì)胞的細(xì)胞成分，被認(rèn)為是中胚層發(fā)育的早期細(xì)胞，并具有多向分化潛能，特別是中胚層和神經(jīng)外胚層來源的組織細(xì)胞。體內(nèi)、外實驗均表明BMSCs在一定條件誘導(dǎo)下，可具有神經(jīng)前體細(xì)胞特征，并表現(xiàn)出類似神經(jīng)干細(xì)胞的特性：具有在腦內(nèi)定向遷移、彌散、分化的位置決定性、整合及“歸巢”等能力。而且，BMSCs來源

4、豐富，取材簡便、易分離、純化、培養(yǎng)，在一定的條件下可迅速體外擴增；同時自體骨髓源性神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs-D-BMSCs)在移植中治療中也避免了免疫排斥反應(yīng)的發(fā)生。因此，將基因工程與干細(xì)胞移植，尤其是與NSCs-D-BMSCs結(jié)合，為PD的真正治愈提供了廣闊的前景。 本研究將采用分子克隆技術(shù)構(gòu)建pEGFP-TH質(zhì)粒，同時攜帶指示基因EGFP(綠色熒光蛋白)及治療基因(大鼠TH)，經(jīng)酶切鑒定后，在NucleofectorTM技術(shù)下將

5、pEGFP-TH轉(zhuǎn)染NSCs-D-BMSCs，進行體外擴增，并對融合蛋白(EGFP和TH)的共表達(dá)進行免疫組化鑒定。同時，應(yīng)用6-OHDA立體定向注射雙點間隔毀損的方法制作PD大鼠模型，并對其進行行為學(xué)、免疫組化及遞質(zhì)含量等方面評價。然后分別通過鼠尾靜脈、頸內(nèi)動脈、腦室及紋狀體四種移植途徑，將TH修飾的NSCs-D-BMSCs移植到帕金森病大鼠模型體內(nèi)，分別在移植后各時間點，觀察移植后大鼠行為學(xué)改變、記錄阿樸嗎啡(Apo)誘發(fā)旋轉(zhuǎn)圈數(shù)變

6、化、HPLC方法測定腦內(nèi)DA遞質(zhì)濃度、原位雜交方法示蹤移植細(xì)胞遷移位置及熒光定量PCR方法測定各組織或部位移植細(xì)胞的拷貝數(shù)，綜合評價各種移植途徑下，pEGFP-TH轉(zhuǎn)染的NSCs-D-BMSCs對PD大鼠的治療效果。 二、本研究目的 旨于探討表達(dá)大鼠TH的NSCs-D-BMSCs在尾靜脈、頸內(nèi)動脈、腦室及紋狀體四種移植途徑下對PD大鼠的治療作用及可能機制，為基因治療PD尋找多種可行的治療途徑，及為干細(xì)胞移植治療神經(jīng)系統(tǒng)退

7、行性疾病在臨床中的應(yīng)用提供試驗依據(jù)。因此，本研究共分三個部分： 第一部分探討骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的提取、純化及誘導(dǎo)為神經(jīng)干細(xì)胞的方法，誘導(dǎo)后NSCs-D-BMSCs的免疫學(xué)鑒定，以及NSCs-D-BMSCs隨著培養(yǎng)時間出現(xiàn)的形態(tài)學(xué)及生物學(xué)特性的變化； 第二部分探討攜帶有綠色熒光蛋白EGFP與大鼠治療基因TH質(zhì)粒pEGFP-TH的構(gòu)建和鑒定，以及NucleofectorTM轉(zhuǎn)染NSCs-D-BMSCs的方法，轉(zhuǎn)染后后融合蛋白TH

8、與指示蛋白EGFP共表達(dá)； 第三部分探討PD大鼠模型的建立的方法和模型的評價，以及攜帶有治療基因TH的NSCs-D-BMSCs通過不同途徑移植后的對PD大鼠的治療效果、療效評價方法及可能治療機制。 三、本試驗主要的方法和結(jié)果： 1.經(jīng)密度梯度離心法分離雄性大鼠BMSCs后5天，倒置顯微鏡下觀察可見大而圓細(xì)胞，形態(tài)學(xué)特征為:細(xì)胞貼壁生長，高倍鏡下可見細(xì)胞內(nèi)顆粒，部分細(xì)胞成梭形，可見兩極突起。10天左右細(xì)胞增殖旺盛，

9、并呈有序排列，細(xì)胞間突起增多，并相互重疊，高倍鏡下似形成連接。CK-8增殖實驗可見：隨著培養(yǎng)時間的推移，細(xì)胞增殖呈倍增趨勢.其中8-11天增殖趨勢明顯；原代BMSCs在經(jīng)我實驗室神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)液(專利號：02134314.4)誘導(dǎo)可表達(dá)Nestin及NSE，并隨著細(xì)胞培養(yǎng)時間的延長，呈現(xiàn)Nestin表達(dá)逐漸減少，NSE表達(dá)逐漸增多趨勢。綜合結(jié)果，本實驗選擇8-11天NSCs-D-BMSCs為轉(zhuǎn)染移植最佳時間，此時NSCs-D-BMSCs

10、增殖旺盛，Nestin表達(dá)細(xì)胞數(shù)量最多； 2.將BamHⅠ酶切pGEMTH-3質(zhì)粒后所得到1.7Kb的TH片段，與同樣經(jīng)酶切pEGFP-C2所得到的4.7Kb的EGFP片段，在T4連接酶作用下連接；新構(gòu)建質(zhì)粒經(jīng)過XhoⅠ和SalⅠ雙酶切鑒定后提示，攜帶了目的基因TH及EGFP； 3.pEGFP-TH質(zhì)粒在NucleofectorTM技術(shù)下轉(zhuǎn)染NSCs-D-BMSCs，程序A-31轉(zhuǎn)染后，可以表達(dá)綠色熒光蛋白，并隨著時間的

11、推移，其表達(dá)率不斷升高。至第5天，流式細(xì)胞儀檢測其EGFP表達(dá)率達(dá)到62.1％，同時，電穿孔作用下約有半數(shù)以上細(xì)胞胞體腫脹，最后死亡；所轉(zhuǎn)染NSCs-D-BMSCs經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定，可以同時表達(dá)EGFP及大鼠TH，5天后其EGFP和TH融合蛋白表達(dá)的嵌合率約為83.5％； 4.采用間隔單側(cè)注射6-OHDA立體定向毀損大鼠SNc和VTA雙點，可成功制備PD中晚期偏側(cè)大鼠模型，成功率達(dá)到82.5％；經(jīng)Apo誘發(fā)旋轉(zhuǎn)試驗、腦內(nèi)DA遞

12、質(zhì)含量測定及免疫組化檢測提示：毀損后4-6周模型癥狀及各項檢測指標(biāo)趨于穩(wěn)定，并能夠至少可以穩(wěn)定持續(xù)16周；說明6-OHDA毀損大鼠單側(cè)VTA及SNc可以模擬PD中、晚期臨床癥狀，為進一步進行PD基因治療的實驗研究及其長期觀察提供了一種良好的動物模型； 5.移植后腦室組及紋狀體組大鼠較其他移植組活動增多，自主覓食能力明顯增強，活動范圍增大；10周后，在APO誘發(fā)旋轉(zhuǎn)下，靜脈組、動脈組、腦室組及紋狀體組大鼠旋轉(zhuǎn)圈數(shù)分別為8.3、7.

13、7、5.7及5.0圈/分，各組大鼠行為學(xué)均有明顯改善，其中紋狀體組及腦室組更為明顯； 6.移植后4周和10周后，對各移植組大鼠右側(cè)黑質(zhì)紋狀體區(qū)DA含量的HPLC結(jié)果顯示：各組神經(jīng)遞質(zhì)含量均有提高，其中以紋狀體組及腦室組更為明顯，分別為0.89和0.63μg/g腦組織濕重； 7.移植后4周及10周后，腦室組及紋狀體組可在移植部位看到綠色熒光表達(dá)，腦室組可見表達(dá)熒光細(xì)胞沿腦室底神經(jīng)纖維束狀延伸可達(dá)腦室底2.6mm；而紋狀體組

14、可見沿針道帶狀延伸，最遠(yuǎn)可達(dá)針道下4.6mm；但是靜脈組及動脈組未見到明確腦組內(nèi)綠色熒光蛋白表達(dá)； 8.熒光定量PCR結(jié)果提示，靜脈移植組可檢測到骨髓(39.8％)、硬腦膜(0.2％)及心臟(60.0％)內(nèi)有陽性反應(yīng)拷貝分布；動脈移植組內(nèi)心臟(60.2％)、肝臟(35.8％)、嗅腦(0.03％)及腎臟(4.7％)可見陽性拷貝分布；紋狀體組骨髓(1.7％)及紋狀體(98.3％)內(nèi)可見陽性拷貝。 9.數(shù)據(jù)統(tǒng)計：數(shù)據(jù)用平均數(shù)(

15、-x)±標(biāo)準(zhǔn)差(s)表示，并采用SPSS10.0軟件包進行數(shù)據(jù)分析，作單因素或兩因素多樣本均數(shù)比較的方差分析及多重樣本均數(shù)間的Dunnett檢驗，P＜0.05提示有顯著統(tǒng)計學(xué)差異；以及SPSS10.0或Origin6.0圖示分析。 四、全文總結(jié) 本研究對大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞進行分離培養(yǎng)，并在我室神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)液下誘導(dǎo)為神經(jīng)元干細(xì)胞，即NSCs-D-BMSCs；應(yīng)用分子克隆技術(shù)構(gòu)建了pEGFP-TH真核表達(dá)質(zhì)粒，同時攜帶了指

16、示蛋白EGFP及治療基因TH；將構(gòu)建質(zhì)粒在NucleofectorTM技術(shù)下轉(zhuǎn)染NSCs-D-BMSCs，獲得治療基因TH及指示蛋白綠色熒光蛋白的共表達(dá)；采用單側(cè)間隔注射6-OHDA立體定向毀損大鼠SNc和VTA雙點，成功制備了偏側(cè)PD中晚期大鼠模型。將TH修飾的NSCs-D-BMSCs經(jīng)靜脈、動脈及立體定向下腦室內(nèi)及紋狀體內(nèi)注射四種途徑下移植到PD大鼠體內(nèi)，通過對移植后PD大鼠行為改變、DA遞質(zhì)含量變化、移植細(xì)胞原位表達(dá)及移植細(xì)胞在移

17、植后各組織含量等方面檢測，綜合評價顯示：四綜移植途徑下，PD大鼠癥狀均有所改善，其中紋狀體移植組在Apo誘發(fā)下旋轉(zhuǎn)圈數(shù)減少的、局部DA含量提高及移植細(xì)胞的原位遷移距離等方面最為明顯；而腦室組其次，但是未見到移植細(xì)胞的紋狀體遷移；血管組(動脈移植及靜脈移植組)最不明顯，然而腦內(nèi)同樣存在移植細(xì)胞的表達(dá)，但是拷貝數(shù)較低。提示各種移植途徑下的治療機制可能不盡相同：腦室及紋狀體組移植細(xì)胞在腦內(nèi)存活，并增加了腦內(nèi)局部DA含量，起到治療作用，其中紋狀