lentivirus介導(dǎo)表達(dá)多基因的人胚基因工程神經(jīng)干細(xì)胞的實驗研究

1、2 8 8罔脊柱 脊髓 雜志 2 0 0 5 年第 1 5卷第 5期C h i n e s eJ o u r m di n ec m d卻i m dC o r d ， 2 0 0 5 ， V o 1 ． 1 5 ， N o ． 5L e n t i v i r u s 介 導(dǎo) 工程神 經(jīng) 表達(dá)多基 因的人胚基 因干細(xì)胞 的實驗研 究 蔡培 強 ’ ， 湯遜 ’ ， 林月秋 ’ ， O U D E G AM， B L I T SB， 陽運

2、康 ’ ， 徐 林 ， 周田華 ’( 1成都 軍區(qū) 昆明總醫(yī) 院骨科 6 5 { } 0 3 2 昆明市 ； 2T h eMi a m iP r o j e c tt oC u r eP a r a l y s i s ， U n i v e r s i t yo fMi a m iS c h o o lo fM e d i c i n e ． M i a mi ， F L3 31 ( ) 1 ． US A； 3Gr a d u a

3、t eS c h o o lf o rN e u r o s c i e n c e sAms t e r d a m ， Ne t h e r l a n d sI n s t i t u t ef orBr a i nR e s e a r c h ． A m s t e r d a m． T h eN e t h e r l a n d s ： 4 中國科學(xué)院 昆明動物 研究所 6 5 ( ) ( ) ( ) ( ) )【 摘要

4、】 目的 ： 探索 以 L e n t i v i r u s 為載體 ， 構(gòu)建 同時攜 帶并表 達(dá)多基 的基 T程 人胚神經(jīng)干 細(xì)胞 ( h u m a nn e u —r a ls t e mc e l l ， h N S C ) 的可行性 ， 為脊髓損 傷治療 的研 究提供材料 。方法 ： 培 養(yǎng)和鑒定 h N S C ； 用攜帶綠 色熒光蛋 白( g r e e nf l u o r e s c e n c ep r o t e

5、 i n ， G F P ) 和神經(jīng) 營養(yǎng) 兇子一 3 ( n e u r o t r o p h i cf a c t o r 一 3 ， N T 一 3 ) 的 L e n t i v i r u s 轉(zhuǎn) 染 h N S C ；用熒光顯做鏡 觀察 、 鼠胚 背根神經(jīng)結(jié)培 養(yǎng)( d o r s a lr o o tg a n g l i o n ， D R G) 和 S l o tb l o t 等方法檢測 基因T程 h N S C的

6、 多基 因表達(dá)情況 。結(jié)果 ： 培養(yǎng) 獲得 了大量 的 h N S C； 熒光 微鏡觀 察到兒乎 l 0 0 ％的 h N S C表達(dá) G F P ； 基因 T程 h N S C的培 養(yǎng)液能促 使大 鼠 D R G旺盛生 長 ： S l o tb l o t 檢測到 基因 T程 h N S C能 高效 分泌 N T 一 3蛋 白。結(jié) 論 ： 以 L e n t i v i r u s 為載體能 構(gòu)建同時攜帶 并穩(wěn)定表達(dá) 多基 I X l

7、 的基 T程 h N S C ．為脊髓損傷治 療的基礎(chǔ)研 究及進一 步臨床應(yīng)用提 供了有價值的細(xì)胞 資源 【 關(guān)鍵 詞 】L e n t i v i r u s ； 人胚神經(jīng)干細(xì)胞 ； 基 因T程 ； 神經(jīng)營 養(yǎng)因子一 3 ； 綠 色熒光蛋 白中圖分類號 ： R 3 I 8 、 5文獻(xiàn)標(biāo)識碼 ： A文章 編號 ： l 0 0 4 — 4 0 6 X( 2 0 0 5 ) 一 0 5 — 0 2 8 8 — 0 4Th ee x p e

8、r i me nt a ls t u d yo fg e n e t i ce n g i n e e r i n gh u m a nn e u r a ls t e m c e l le x p r e s s i n gm u l t i g e n eme d i a t e db yL e n t i v i r u s ／ C AIP e i q i a n g 。 T AN G Xu n ， L I NYu e q i

9、u。 e ta ~ ／ C h i n e s eJ o u r n a lo fS p i n ea n dS p i n a lC o r d ，2 0 0 5 ， 1 5 ( 5 ) ： 2 8 8 ～ 2 9 1【 A b s t r a c t 】 O b j e c t i v e ： T oe x p l o r et h ef e a s i b i l i t yt oc o n s t r u c tt h eg e

10、 n e t i ce n g i n e e r i n gh u m a nn e u r a ls t e mc e l l( h N S C)w h i c hw e r eme d i a t e db yL e n t i v i r ust oe x p r e s sm u l t i g e n e ． a n da f f o r dt h em a t e r i a lf o rt h ef u r t h e

11、rs t u d i e so fs p i n a lc o r di n j u r y ． Me t h o d ： A f t e rt h eh N S Cw e r ei s o l a t e da n di d e n t i f i e d ． t h eh N S Cw e r eg e n e t i e l ym o d i f i e db yL e n t i v i r use x p r e s s i

12、n gg r e e nf l u o r e s c e n c ep r o t e i n ( G F P)a n dn e u r o t r o p h i cf a c t o r 一 3 ( N T 一 3 ) ． T h et r a n s g e n i cc o mp l e xe x p r e s s i o nw e r ee x a mi n e db yt h eme t h o d so ff l u

13、o r e s c e n c emi c r o s c o p e ， c u l t u r in gw i t hd o r s a lr o o tg a n —g l i o no ff e t a lr a t sa n ds l o tb l o t ． Re s u l t ： T h eg e n e t i ce n g i n e e r i n gh NS Cw a sc o n s t r uc t e ds

14、 u c c e s s f u l l y ． Ex p r e s s i o no fb r i g h tg r e e nf l u o r s c e n c ewe r ed e t e c t e di na l lg e n e t i ce n g i n e e r in gh NS Cb yt h ef l u o r e s c e n c emi c r o s c o p e ． T h ec o n d

15、i t i o n e dme d i u m wi t ht r a n s g e n i ch NS Cc o u l di n d u c en e u r i t ef l o u r is h i n go u t g r o w t ho fd o r s a lr o o tg a n g l i o n( D R G) ． T h eg e n e t i ce n g i n e e r i n gh N S Ce

16、x p r e s s e dh i g hl e v e lo fN T - 3w h i c hc o u l db ed e t e c t e db yt h em e t h o d so fs l o tb l o t ． Co n c l u s i o n： T h eg e n e t i ce n g i n e e r i n gh NS Cme d i a t e db yL e n t i v i r use

17、x p r e s s i n gmu l t i g e n ec a nb ea p p l i e dw i d e l yi nt h eb a s i cr e s e a r c ha n dt h ef u r t h e rc l i n i ca p p l i c a t i o na sn e u r a lg r a f t sf o rs p i n a lc o r di n j u r yw i l lb

18、eg r e a t ．【 K e yw o r d s 】L e n t i v i r u s ； H u m a nn e u r a ls t e mc e l l ；G e n e t i ce n g i n e e r i n g ；N e u r o t r o p h i cf a c t o r 一 3 ；G r e e nf l u o r e s —e e n c ep r o t e i n【 A u t h

19、o rSa d d r e s s 】 D e p a r t m e n to fO r t h o p a e d i c s ，K u n m i n gG e n e r a lH o s p i t a lo fC h e n d uM i l i t a r yC o m m a n d ，Ku n mi n g， 6 5 0 0 3 2， Ch i n a脊髓 損傷 ( s p i n a lc o r di n j u

20、r y ， S C I ) 后 的再生 基金項 目： 云南省 一然科學(xué)基金資助項 目( 2 0 0 2 C 0 0 7 0 M)第一作者簡 介 ： 男( 1 9 7 4 一 ) ， 主治醫(yī) 師， 碩士 研究生 ． 研究方 向 ： 脊 柱脊髓 損傷通訊作者 ： 湯遜 電 話 ： ( 0 8 7 1 ) 4 0 7 4 6 5 7E — ma i l ： T a n g x u n 6 2 0 9 @1 6 3 n e t修復(fù)一直是醫(yī)學(xué)科學(xué)

21、領(lǐng)域 內(nèi)的一大難題 。一方面 脊髓的原發(fā)性損傷及其繼發(fā)的病理生理改變導(dǎo)致 脊髓內(nèi)功能細(xì)胞缺失 ：另一方面神經(jīng)營養(yǎng) 因子或 誘導(dǎo)因子不足 ，致使絕大部分軸突的再生努力歸 于失敗 ， 即所謂“ 天折性再生” 。 如何改變 S C I 后不 適宜再生 的微環(huán)境是研究和治療 S C I 急需解決 的維普資訊 http://www.cqvip.com 2 9 0巾圍脊柱脊髓 雜志 2 0 0 5年第 1 5 卷第 5期C h i n e s eJ

22、 o u r m di n ec m di n c a ／ C o r d ， 2 0 0 5 ． V o l1 5 ． N o ． 5牛血清白蛋 白的 T B S封閉液 中封閉 1 h ， 再于羊抗 鼠 N T 一 3一 抗 孵 育 l h ， T r B S漂 洗 3次 ，每 次 1 5 r a i n辣根過氧化物酶 ( H R P ) 標(biāo)記兔抗羊二抗孵 育 l h ， T r B S漂洗 3次 ， 每次 1 5 m i n ， D

23、 A B顯色。2 結(jié) 果 2 ． 1h N S C體外培養(yǎng)體系建立 由流產(chǎn)胎兒大腦皮層分離培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng) 2 周 無血 清加 b F G F 、 E G F和 B 2 7培養(yǎng)后 ．細(xì)胞 呈 團狀 。 懸浮生長 ． ． 細(xì)胞集落中的細(xì)胞數(shù) 目 有數(shù)十 、 甚 至數(shù)百個不等( 圖 l a ， 后插頁 Ⅱ) 。加入血清誘導(dǎo) 分化后 ， 細(xì)胞 團 1 ～ 2 d 開始貼壁分化 ， N S C團呈放 射狀發(fā)出許 多軸突 ， 相互交錯呈 網(wǎng)狀 ( 圖

24、 1 b ， 后插 頁 Ⅱ) 。原代培養(yǎng)時， 培養(yǎng)瓶中可見一些飄浮細(xì)胞 碎片和一些貼壁生長的雜細(xì)胞 ， 但經(jīng)傳代后 ， 這些 雜細(xì)胞均減少甚至消失 ， 細(xì)胞集落培養(yǎng) 1 3 代 以上 仍具有干細(xì)胞特性 ． 經(jīng) N e s t i n免疫組化染色陽性 ( 圖 2 a ， 后捅 頁 Ⅱ) 。分化 的細(xì)胞有 的為 1 ～ 2 個或 多個突 起 的呈 N F 一 2 0 0免疫 染 色 陽性 的神 經(jīng)元 ( 圖 2 b ． 后捅貞 Ⅱ) ： 有

25、的 為多突起 的呈 G F A P免 疫染色陽性 的星形 膠質(zhì)細(xì)胞 ( 圖 2 c ， 后插 頁 Ⅱ) 。這種從流產(chǎn)胎兒大腦皮層分離的細(xì)胞能夠 自我更 新 ， N e s t i n染色陽性 ， 具有分化為神經(jīng)元和星形膠 質(zhì)細(xì)胞的能力 ， 證明其為 h N S C 。2 ． 2 基因工程 h N S C的熒光顯微鏡觀察 在倒 置相差熒光顯微鏡下 可見 到 h N S C呈現(xiàn) 強度適中的熒光 ， 單個細(xì)胞熒光強度稍弱 ， 多個細(xì)胞 聚集的

26、神經(jīng)球熒光較強 ，說 明這些 h N S C可表 達(dá)轉(zhuǎn)入的報告基因 G F P ( 圖 3 a 、 3 b ， 后捅頁 Ⅱ) 。2 - 3 生物 學(xué) 活性 檢測 妊 1 4 d胎鼠的 D R G培養(yǎng) 4 8 h 后 ． 可見到轉(zhuǎn) 基 因 h N S C上清液培養(yǎng)組 D R G旺盛生 長 ，軸 突從 D R G密密麻麻地長 出 ， 呈細(xì)絲 狀 ． 并 不斷地發(fā) 出分 支 ， 相互交錯成 網(wǎng)狀 ， 長度甚 至超過 D R G的直 徑． 但沒

27、有神經(jīng)元 向外遷徙( 岡 4 a ， 后捅頁 Ⅱ) 。表 明培養(yǎng)液中含有較高濃度 的 N T 一 3 蛋 白．能夠促 進胎 鼠 D R G軸突的旺盛生長 。 普通 h N S C上清液 組無軸突生長( 圖 4 b ， 后插頁Ⅲ) 。 而含 1 ％胎牛血 清的 D M E M ／ F 1 2培養(yǎng) 液組有稀疏 的軸突從 D R G中長出 ， 但長度較短。 說明胎牛血清能在一定程度 上促進 D R G的軸突生長。2 ． 4S l o tb l

28、 o t 檢 測 在 S l o tb l o t 的硝酸纖 維膜上 ，轉(zhuǎn)基 因 h N S C上清液組 在鉛筆所 畫圈內(nèi)可見到一黃色斑點 ， 其 它兩個圈內(nèi)無陽性 發(fā)現(xiàn)( 圖 5 ， 后插 頁Ⅲ) 。 說 明轉(zhuǎn) 基因 h N S C培養(yǎng)上清液中含有較高濃度的 N T 一 3 。3 討 論 3 ． 1h N S C的基本特性 h N S C作為十細(xì)胞 的一種 ， 具有其它所有干細(xì) 胞 的基本特征 ， 具有 自我更新 、 增殖分裂能力和多

29、向分 化潛能 ，可 以分 化為本 系統(tǒng)大部 分類型 細(xì)胞I - I 。 但它與鼠胚 N S C又有所不 同， 在體外培養(yǎng)過 程 中， 鼠胚 N S C僅需 b F G F 或 者 E G F中的一種因子 即可 ，而 h N S C必須同時使用 b F G F和 E G F兩 種 有絲 分裂 抑制 劑方 能維持 h N S C的未 分化狀 態(tài) 。 有研究表明 ， 在 h N S C的培養(yǎng)過程中使用 白血 病抑 制 【 大 j 子 ( 1

30、e u k e m i ai n h i b i t o r yf a c t o r ， L I F ) 可 以大大延長干細(xì)胞 的體外培養(yǎng)時間 ．兇為 L I F可以上 調(diào)細(xì)胞 中端 粒酶 的濃度 ，端粒酶 能修復(fù)每 次h N S C分 裂后短縮 的端粒 ， 從而延長 h N S C在體外 培養(yǎng)的時間L 2 , 3 I本實驗聯(lián)合噍用有絲分裂抑制劑 b F G F和 E G F對 h N S C已培養(yǎng)了 1 3代 ， 超過 5 個 月

31、．從不同時期 的 h N S C均能誘 導(dǎo)分化得到神經(jīng) 元和星形膠質(zhì)細(xì)胞 。3 ． 2L e n t i v i r u s 的特性 及其作為轉(zhuǎn)基 因載體的優(yōu) 點L e n t i v i r u s 的染 色體是二倍體 ， 包含一條正鏈 R N A ， 可 以通過 逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)化 為 D N A( 即所謂 的前 病毒 ) ， 然后通過和宿主染色質(zhì)的一系列復(fù)雜的相 互作用整合到宿主的染色體中。 與 R V和 A A V相 比較 ， (它的前

32、病毒整合到宿主的染色體中后 ． 可直接利用宿主的 R N A聚合酶合成病毒轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 ．而不需要依賴于宿主 D N A的復(fù)制 ． 所 以它既能 感染分裂活躍期細(xì)胞 ，義能高效率地感染非分裂 活躍期細(xì)胞 ． 甚至靜止期細(xì)胞II ； ② 在其構(gòu) 建過程 中增 加 了一種 口腔粘膜水皰病毒糖 蛋 白 ( V S V —G) ， 使其感染宿主更為廣泛。V S V — G既增加 了病 毒顆粒識別和親和更多宿主的能力 ( 幾乎可以感 染所有類 型的宿