VEGF轉(zhuǎn)染對(duì)骨髓間質(zhì)干細(xì)胞及對(duì)粥樣硬化動(dòng)脈TFPI的影響.pdf

1、動(dòng)脈粥樣硬化病變中VEGF與TFPI呈同相改變，且密切相關(guān)，但其相互作用機(jī)制并不清楚。本實(shí)驗(yàn)設(shè)想通過(guò)調(diào)節(jié)VEGF基因觀察TFPI的變化，進(jìn)一步探討二者的關(guān)系，尋找同相調(diào)節(jié)二者的方法，達(dá)到既穩(wěn)定血管內(nèi)皮又抑制血栓形成的作用，以達(dá)到更有效治療動(dòng)脈粥樣硬化目的。 骨髓間質(zhì)干細(xì)胞是一種具有高度增殖和分化能力的成體干細(xì)胞。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)骨髓間質(zhì)干細(xì)胞在特定的條件下還可以向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化。骨髓間質(zhì)干細(xì)胞不僅具有干細(xì)胞的共性，而且具有來(lái)源豐富、

2、無(wú)免疫排斥、無(wú)年齡限制、無(wú)倫理學(xué)爭(zhēng)議，能夠轉(zhuǎn)染和長(zhǎng)期表達(dá)外源性基因。本實(shí)驗(yàn)選擇骨髓間質(zhì)干細(xì)胞為工程細(xì)胞。 RNA干擾是目前最有效的基因沉默技術(shù)，能特異性抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而下調(diào)相應(yīng)蛋白質(zhì)水平及功能，它能快速而準(zhǔn)確敲除特定基因。許多研究在動(dòng)物疾病模型或培養(yǎng)細(xì)胞中，利用該項(xiàng)技術(shù)阻斷相關(guān)基因的表達(dá)。 本研究通過(guò)轉(zhuǎn)染VEGF和沉默VEGF觀察TFPI變化，初步了解二者的相互關(guān)系，探索以骨髓間質(zhì)干細(xì)胞為工具的基因治療，尋找新的有效的動(dòng)脈

3、粥樣硬化治療方法。 一、載體的構(gòu)建 目的：構(gòu)建pcDN-A3.1(-)VEGF真核表達(dá)載體；構(gòu)建針對(duì)VEGF的發(fā)卡樣siRNA真核表達(dá)載體pU-VEGF-siRNA，為進(jìn)一步研究其對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的作用奠定基礎(chǔ)。 方法 應(yīng)用DNA重組方法，將編碼VEGF cDNA定向克隆于真核表達(dá)載體pcDNA3.1(-)中，構(gòu)建pcDNA3.1(-)VEGF真核表達(dá)質(zhì)粒，通過(guò)酶切及測(cè)序鑒定；合成一對(duì)互補(bǔ)并編碼相應(yīng)短發(fā)夾狀

4、VEGF-siRNA的寡核苷酸鏈，將其插入到pSilencer<'TM>2.1-U<,6> neo載體中，經(jīng)測(cè)序鑒定所構(gòu)建的重組載體是否正確。 結(jié)果 酶切結(jié)果與相應(yīng)的載體和基因相同，對(duì)pcDNA3.1(-)VEGF進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果表明VEGF已正確克隆到pcDNA3.1(-)質(zhì)粒；測(cè)序示pU-VEGF-siRNA序列正確。 結(jié)論 pcDNA3.1(-)VEGF、pU-VEGF-siRNA真核表達(dá)載體構(gòu)建成功

5、。 二、VEGF對(duì)人骨髓間質(zhì)干細(xì)胞TFPI的影響 目的:建立骨髓間質(zhì)干細(xì)胞分離、培養(yǎng)的方法，觀察其生物學(xué)特性，對(duì)分離、培養(yǎng)的骨髓間質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行鑒定；觀察真核表達(dá)載體peDNA3.1(-)VEGF、pU-VEGF-siRNA轉(zhuǎn)染骨髓間質(zhì)干細(xì)胞后VEGF、TFPI mRNA表達(dá)的變化及VEGF、TFPI蛋白質(zhì)水平的變化。 方法 1．抽取幼兒骨髓，Pereoll溶液密度梯度離心法分離后，將細(xì)胞重懸在人的骨髓間質(zhì)

6、干細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)，檢測(cè)其生物學(xué)特性及多向分化潛能。 2．脂質(zhì)體介導(dǎo)pcDNA3.1(-)VEGF質(zhì)粒轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的骨髓間質(zhì)干細(xì)胞，熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效果，RT-PCR方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后骨髓間質(zhì)干細(xì)胞VEGF、TFPI mRNA表達(dá)水平，免疫印跡法半定量檢測(cè)轉(zhuǎn)染后骨髓間質(zhì)干細(xì)胞VEGF、TFPI蛋白質(zhì)水平，MTT法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后骨髓間質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)上清液VEGF的生物學(xué)活性； 3．脂質(zhì)體介導(dǎo)pU-VEGF-siRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染體外培

7、養(yǎng)的骨髓間質(zhì)干細(xì)胞，熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效果，RT-PCR方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后骨髓間質(zhì)干細(xì)胞VEGF、TFPI mRNA表達(dá)水平，免疫印跡法半定量檢測(cè)轉(zhuǎn)染后骨髓間質(zhì)干細(xì)胞VEGF、TFPI蛋白質(zhì)水平。 結(jié)果 1．骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性：原代細(xì)胞接種后，72小時(shí)首次換液，細(xì)胞貼壁后胞漿充盈，外觀呈梭形，7天后可見(jiàn)形狀均一的細(xì)胞組成的集合，即為骨髓間質(zhì)干細(xì)胞集落。骨髓間質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)到亞融合狀態(tài)時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)，傳至第5代，骨髓間

8、質(zhì)干細(xì)胞被純化，多次傳代后的細(xì)胞呈均勻有序的成纖維樣細(xì)胞；不同的換液時(shí)間對(duì)原代骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的生長(zhǎng)影響差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；不同代骨髓間質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)曲線基本相同，3天進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，6天達(dá)高峰，以后進(jìn)入平臺(tái)期；不同代骨髓間質(zhì)干細(xì)胞貼壁率相似，隨時(shí)間推移增高，增高速度先快后慢；骨髓間質(zhì)干細(xì)胞增殖活性在一定的范圍內(nèi)隨著血清濃度的增加而增大，當(dāng)血清濃度超過(guò)20％時(shí)，細(xì)胞增殖活性不再增高；骨髓間質(zhì)干細(xì)胞增殖活性在一定種植密度范圍內(nèi)隨種植細(xì)胞數(shù)量增加

9、而增高，在種植細(xì)胞密度為10×10<'4>/ml時(shí)，增殖活性最高； 2．所培養(yǎng)的骨髓間質(zhì)干細(xì)胞在特定的培養(yǎng)條件下具有向脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞分化的能力，符合判斷骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的金標(biāo)準(zhǔn)。 3．熒光顯微鏡示脂質(zhì)體介導(dǎo)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的骨髓間質(zhì)干細(xì)胞成功，效率較高；與對(duì)照組相比，VEGF、TFPI mRNA表達(dá)水平在pcDNA3.1(-)VEGF轉(zhuǎn)染組顯著增高，pU-VEGF-siRNA轉(zhuǎn)染組顯著降低，空載體轉(zhuǎn)染組無(wú)明顯

10、變化； 4．與對(duì)照組相比，VEGF、TFPI蛋白質(zhì)水平在pcDNA3.1(-)VEGF轉(zhuǎn)染組顯著增高，pU-VEGF-siRNA轉(zhuǎn)染組顯著降低，空載體轉(zhuǎn)染組無(wú)明顯變化；與未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組相比，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(-)VEGF真核表達(dá)載體的骨髓間質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)上清液的內(nèi)皮細(xì)胞組M80處的吸光值明顯增高，轉(zhuǎn)染空載體質(zhì)粒、PU-VEGF-siRNA質(zhì)粒組無(wú)變化。 結(jié)論 1．所分離、培養(yǎng)的骨髓間質(zhì)干細(xì)胞是純的、可長(zhǎng)期傳代、擴(kuò)

11、增、穩(wěn)定的骨髓間質(zhì)干細(xì)胞。 2．轉(zhuǎn)染VEGF基因可提高骨髓間質(zhì)干細(xì)胞VEGF、TFPI mRNA表達(dá)水平，上調(diào)其VEGF、TFPI蛋白質(zhì)水平； 3．轉(zhuǎn)染VEGF-siRNA基因可降低骨髓間質(zhì)干細(xì)胞VEGF、TFPImRNA表達(dá)水平，下調(diào)其VEGF、TFPI蛋白質(zhì)水平。 4．VEGF基因轉(zhuǎn)染骨髓間質(zhì)干細(xì)胞后，其培養(yǎng)上清液具有較強(qiáng)的促內(nèi)皮細(xì)胞增生作用。 三、VEGF對(duì)SD大鼠主動(dòng)脈組織TFPI的影響

12、目的:建立SD大鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型；觀察尾靜脈注射轉(zhuǎn)基因骨髓間質(zhì)干細(xì)胞對(duì)SD大鼠主動(dòng)脈組織VEGF、TFPI mRNA表達(dá)的變化及其VEGF、TFPI蛋白質(zhì)水平的變化。 方法 1．66只雄性SD大鼠隨機(jī)分為6組，每組11只，分別為A、B、C、D、E、F組，A組喂養(yǎng)普通飼料， B、C、D、E、F組喂養(yǎng)動(dòng)脈粥樣硬化飼料。超聲及病理檢查升主動(dòng)脈、主動(dòng)脈弓、降主動(dòng)脈、腹主動(dòng)脈。 2．SD大鼠造模型成功后，經(jīng)尾靜脈向大鼠體

13、內(nèi)注入不同無(wú)血清培養(yǎng)基，每只鼠注射1ml，其中含骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)基中細(xì)胞密度為6×10<'7>/ml；A組不含任何成分的無(wú)血清培養(yǎng)基，B組不含任何成分的無(wú)血清培養(yǎng)基，C組含未經(jīng)任何干預(yù)的骨髓間質(zhì)干細(xì)胞，D組含轉(zhuǎn)染空載體質(zhì)粒的骨髓間質(zhì)干細(xì)胞，E組含轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(-)VEGF質(zhì)粒的骨髓間質(zhì)干細(xì)胞，F(xiàn)組含轉(zhuǎn)染pU-VEGF-siRNA質(zhì)粒的骨髓間質(zhì)干細(xì)胞。 3．飼養(yǎng)一周后超聲及病理檢查升主動(dòng)脈、主動(dòng)脈弓、降主動(dòng)脈、腹主動(dòng)脈

14、，RT-PCR方法檢測(cè)主動(dòng)脈組織VEGF、TFPI mRNA表達(dá)水平，免疫印跡法半定量檢測(cè)主動(dòng)脈組織VEGF、TFPI蛋白質(zhì)水平。 結(jié)果 1．對(duì)照組SD大鼠主動(dòng)脈未出現(xiàn)病變，動(dòng)脈粥樣硬化組大鼠3月后超聲及病理可以檢測(cè)到主動(dòng)脈動(dòng)脈粥樣硬化斑塊。 2．經(jīng)尾靜脈注射骨髓間質(zhì)干細(xì)胞后超聲及病理可以檢測(cè)到動(dòng)脈粥樣硬化斑塊較前無(wú)明顯變化。 3．與正常鼠相比，主動(dòng)脈組織VEGF、TFPI mRNA表達(dá)水平在注射轉(zhuǎn)染pc

15、DNA3.1(-)VEGF基因骨髓間質(zhì)干細(xì)胞模型鼠組顯著增高，注射轉(zhuǎn)染pU-VEGF-siRNA基因骨髓間質(zhì)干細(xì)胞模型鼠組顯著降低，未注射骨髓間質(zhì)干細(xì)胞模型鼠組、注射正常骨髓間質(zhì)干細(xì)胞模型鼠組、注射轉(zhuǎn)染空載體骨髓間質(zhì)干細(xì)胞模型鼠組無(wú)明顯變化。 4．與正常鼠相比，主動(dòng)脈組織VEGF、TFPI蛋白質(zhì)水平在注射轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(-)VEGF基因骨髓間質(zhì)干細(xì)胞模型鼠組顯著增高，注射轉(zhuǎn)染pU-VEGF-siRNA基因骨髓間質(zhì)干細(xì)胞模型

16、鼠組顯著降低，未注射骨髓間質(zhì)干細(xì)胞模型鼠組、注射正常骨髓間質(zhì)干細(xì)胞模型鼠組、注射轉(zhuǎn)染空載體骨髓間質(zhì)干細(xì)胞模型鼠組無(wú)明顯變化。 結(jié)論 1．成功建立SD大鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型。 2．骨髓間質(zhì)干細(xì)胞對(duì)模型鼠主動(dòng)脈組織VEGF、TFPI mRNA表達(dá)水平，VEGF、TFPI蛋白質(zhì)水平無(wú)影響； 3．轉(zhuǎn)染VEGF基因的骨髓間質(zhì)干細(xì)胞可提高模型鼠主動(dòng)脈組織VEGF、TFPI mRNA表達(dá)水平，上調(diào)其VEGF、TFPI蛋白