Tanaproget對(duì)兔動(dòng)脈粥樣硬化斑塊MLCK表達(dá)的影響及機(jī)制.pdf

1、背景：動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是心血管系統(tǒng)中最常見的疾病之一。近百年來，心血管系統(tǒng)疾病已成為21世紀(jì)全球首位死因，使世界疾病譜發(fā)生重大變化。AS屬于失去彈性、動(dòng)脈壁增厚的動(dòng)脈硬化范疇，主要累及全身大、中型動(dòng)脈，其經(jīng)歷動(dòng)脈內(nèi)膜脂質(zhì)沉積，纖維化和粥樣斑塊形成等過程，造成管壁增厚變硬、管腔狹窄，在側(cè)支循環(huán)不能代償時(shí)，會(huì)使心、腦、腎等重要器官的血流發(fā)生中斷而引起缺血、纖維化或壞死，嚴(yán)重影響人類身體健康。AS的發(fā)病機(jī)制

2、非常復(fù)雜，經(jīng)過百余年的研究曾提出脂質(zhì)浸潤、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等多種學(xué)說。但近來發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷也是 AS發(fā)生的重要機(jī)制，有研究稱，血管內(nèi)皮損傷是AS形成的始動(dòng)環(huán)節(jié)。肌球蛋白輕鏈激酶（MLCK)介導(dǎo)的MLC磷酸化在內(nèi)皮通透性變化中發(fā)揮重要作用。第18位絲氨酸和第19位蘇氨酸被磷酸化的MLC可激活肌球蛋白重鏈頭部 ATP酶產(chǎn)生能量，進(jìn)而使內(nèi)皮細(xì)胞肌球蛋白 II與肌動(dòng)蛋白相互作用，引起細(xì)胞收縮使細(xì)胞間隙增大，內(nèi)皮通透性增加。增大的血管內(nèi)皮

3、通透性便于血液中的脂質(zhì)成分滲透至內(nèi)皮下，加速AS的形成。絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，在許多信號(hào)傳遞途徑中發(fā)揮重要作用。細(xì)胞間信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）是MAPK家族中（包括JNK，ERK和p38）主要的成員之一。有研究稱，ERK能夠提高內(nèi)皮細(xì)胞 MLCK活性和MLC磷酸化水平，造成細(xì)胞間連接破壞和間隙形成。又有研究稱，MAPK的作用可被孕酮抑制。Tanaproget(TNPR)是一種新型非甾體類孕酮受體激動(dòng)劑

4、，可與多種生物體的孕酮受體(PR)緊密結(jié)合。近年來性激素對(duì)心血管疾病的保護(hù)作用已被廣泛研究，但作為一種新型藥物，TNPR對(duì)心血管疾病，特別是對(duì)AS的影響研究尚少。因此，本研究擬在建立AS兔模型的基礎(chǔ)上，探討TNPR是否能夠通過MAPK途徑影響MLCK表達(dá)及內(nèi)皮通透性，發(fā)揮抗AS的作用。
　　目的：應(yīng)用高膽固醇飲食加靜脈注射牛血清白蛋白的方法建立新西蘭兔AS模型；探討TNPR在AS模型兔中對(duì)MLCK表達(dá)及內(nèi)皮通透性的影響；探討TNP

5、R對(duì)AS模型兔動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞MLCK表達(dá)的影響是否通過 MAPK通路，為AS的治療提供新的靶點(diǎn)。
　　方法：⑴建立AS模型兔：將24只普通級(jí)新西蘭大白兔隨機(jī)分為3組：正常組、AS模型組、TNPR組。正常組給予普通飼料，AS模型組給予高膽固醇飲食加靜脈注射牛血清白蛋白，TNPR組在高膽固醇飲食加靜脈注射牛血清白蛋白的基礎(chǔ)上，每日在飲食中加喂TNPR（10 mg/kg/day），喂養(yǎng)12周后解剖取材；⑵主動(dòng)脈大體標(biāo)本的油紅O染色觀察主動(dòng)

6、脈粥樣斑塊形成情況；⑶主動(dòng)脈冰凍切片免疫熒光法（大分子染料滲透法）分析動(dòng)脈內(nèi)膜通透性；⑷免疫組化法和Western blot法檢測(cè)主動(dòng)脈MLCK蛋白水平；qRT-PCR檢測(cè)MLCK的mRNA水平；Western blot檢測(cè)JNK、ERK和p38的磷酸化水平。
　　結(jié)果：①喂養(yǎng)12周后新西蘭兔AS模型成功建立：主動(dòng)脈大體標(biāo)本的油紅O染色示：正常組主動(dòng)脈未見明顯斑塊，AS模型組主動(dòng)脈見內(nèi)膜顯著增厚，且有明顯的大而突起的斑塊形成，而T

7、NPR組雖可見斑塊，但與AS模型組相比斑塊明顯減小，內(nèi)膜也變得較平坦；②主動(dòng)脈內(nèi)膜通透性分析：正常組主動(dòng)脈內(nèi)膜中無熒光染料滲透，在AS模型組主動(dòng)脈內(nèi)膜中熒光染料滲透程度明顯增加，而與AS模型組相比，TNPR組熒光染料的滲透程度有所下降，且熒光染料的厚度也有所降低；③免疫組化和Western blot均表明：與正常組相比，AS模型組MLCK蛋白的表達(dá)水平增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），與 AS模型組相比，TNPR組MLCK蛋白的表

8、達(dá)水平有所下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；qRT-PCR顯示，與正常組相比，AS模型組MLCK mRNA的表達(dá)水平增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），與AS模型組相比，TNPR組MLCK mRNA的表達(dá)水平有所下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；④Western blot顯示：與正常組相比，AS模型組pERK,pJNK和pp38的表達(dá)均增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而與AS模型組相比，TNPR組pERK，pJN