寧心痛顆粒干預(yù)模型兔動(dòng)脈粥樣硬化易損斑塊的作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的:1.觀察寧心痛顆粒(由黃芪、川芎、葛根、毛冬青、細(xì)辛組成)對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化易損斑塊的穩(wěn)定作用;2.探討寧心痛顆粒穩(wěn)定易損斑塊的機(jī)制。
　　 方法:42只新西蘭大白兔隨機(jī)分為A、B1、B2、B3和B4組,A組6只,給予普通飼料喂養(yǎng)。B1、B2、B3和B4組每組9只,給予高脂飼料喂養(yǎng),兩周后采用球囊損傷腹主動(dòng)脈,第10周末于球囊損傷部位轉(zhuǎn)染野生型p53基因,12周末處死,處死前48h、24h分別予兩次藥物(中國(guó)斑點(diǎn)蝰蛇毒和組胺)

2、觸發(fā)建立兔動(dòng)脈粥樣硬化易損斑塊模型。第3周起B(yǎng)1、B2、B3組分別予寧心痛顆粒高劑量(寧心痛顆粒2g·kg-1·d-1)、寧心痛顆粒常規(guī)劑量(寧心通顆粒1g·kg-1·d-1)、血脂康膠囊(60mg-kg-1·d-1)干預(yù),B4組作為模型組,不予藥物干預(yù)。各組分別于實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)和處死前取空腹血檢測(cè)總膽固醇(TCH)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)水平,計(jì)算LDL-C/HDL-C、TG/

3、HDL-C及TCH/HDL-C值;各組分別于實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)和藥物觸發(fā)前、藥物觸發(fā)后(處死前)取空腹血檢測(cè)血漿纖維蛋白原(Fib)水平,并用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)血清超敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)、白介素6(IL-6)、基質(zhì)金屬蛋白酶1(MMP-1)、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制物1(TIMP-1)、細(xì)胞間黏附分子1(ICAM-1)、血管細(xì)胞黏附分子1(VCAM-1)水平。各組均以普通病理觀察斑塊形態(tài),測(cè)量纖維帽厚度(FCT)及內(nèi)膜-中膜厚度

4、(IMT),并計(jì)算FCT/IMT比值:透射電鏡觀察斑塊局部的超微結(jié)構(gòu):用免疫組化(IHC)觀察斑塊核因子κB(NF-κB)、單核細(xì)胞趨化因子1(MCP-1)、MMP-1、TIMP-1、ICAM-1、VCAM-1的蛋白表達(dá)情況。采用蛋白印跡技術(shù)(WesternBlot)檢測(cè)斑塊局部NF-κB、MCP-1、MMP-1、TIMP-1的蛋白表達(dá)水平。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)(real-timePCR)檢測(cè)斑塊局部核因子κB抑制蛋白(IκB)、

5、MCP-1、MMP-1、TIMP-1、VCAM-1的mRNA表達(dá)量。采用原位末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)觀察斑塊局部平滑肌細(xì)胞凋亡情況。
　　 結(jié)果:
　　 1.使用新西蘭大白兔,通過(guò)高脂喂養(yǎng)加球囊損傷,外源性p53基因轉(zhuǎn)染,中國(guó)斑點(diǎn)蝰蛇毒(CRVV)和組胺觸發(fā),成功地建立了動(dòng)脈粥樣硬化易損斑塊的動(dòng)物模型。
　　 2.B1組、B2組、B3組實(shí)驗(yàn)兔斑塊IMT低于B4組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P

6、＜0.05);B1組、B2組、B3組斑塊的FCT及FCT/IMT比值均高于B4組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);B1組斑塊IMT、FCT及FCT/IMT比值與B3組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);B1組、B3組FCT/IMT比值高于B2組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 3.透射電鏡顯示B1、B2、B3、B4組實(shí)驗(yàn)兔斑塊局部細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)無(wú)明顯差異。
　　 4.高脂飼料喂養(yǎng)12周后,B1、B2、B3和B

7、4組實(shí)驗(yàn)兔TCH、TG、LDL-C和HDL-C水平較A組明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);B1組TCH、TG、LDL-C水平低于于B4組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);B3組TCH、LDL-C、HDL-C水平低于于B4組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);B1組、B2組、B3組LDL-C/HDL-C、TG/HDL-C及TCH/HDL-C比值與B4組比較無(wú)明顯差異(P＞0.05);B1組TCH、TG、LDL-C、HDL-C水

8、平與B3組相當(dāng),差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);B1組TCH水平低于B2組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 5.觸發(fā)前、觸發(fā)后(處死前)B1、B2、B3、B4組實(shí)驗(yàn)兔血漿纖維蛋白原水平較入組時(shí)升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);B1組、B2組、B3組觸發(fā)前和觸發(fā)后血漿纖維蛋白原水平均稍低于B4組相同時(shí)間點(diǎn)纖維蛋白原水平,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);三者組間比較,差異亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　

9、　 6.觸發(fā)前及觸發(fā)后,B1、B2、B3、B4組實(shí)驗(yàn)兔血清hs-CRP、IL-6、MMP-1、TIMP-1、ICAM-1、VCAM-1水平均較基線升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。藥物觸發(fā)后B1、B3組血清hs-CRP、IL-6、MMP-1、TIMP-1、ICAM-1、VCAM-1水平低于B4組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);B1、B3組間比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);觸發(fā)后B1組hs-CRP、IL-6、TIMP-

10、1水平低于于B2組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 7.IHC顯示B1、B2、B3、B4組實(shí)驗(yàn)兔斑塊局部NF-κB、MCP-1、MMP-1、TIMP-1、ICAM-1、VCAM-1的蛋白表達(dá)水平較A組正常血管明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05):B1組、B3組斑塊局部NF-κB、MCP-1、MMP-1、ICAM-1、VCAM-1的蛋白表達(dá)水平低于B4組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);B1組斑塊局部TIMP-1

11、的蛋白表達(dá)水平低于B4組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);B1組斑塊局部NF-κB、MCP-1、MMP-1、TIMP-1、ICAM-1、VCAM-1的蛋白表達(dá)水平與B3組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);B1組斑塊局部NF-κB、ICAM-1的蛋白表達(dá)水平低于B2組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 8.WesternBlot顯示B1、B2、B3、B4組實(shí)驗(yàn)兔斑塊組織NF-κB、MCP-1、MMP-1、TIMP-1

12、的蛋白表達(dá)水平均高于A組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05):B1組、B2組、B3組斑塊組織NF-κB、MCP-1、MMP-1、TIMP-1的蛋白表達(dá)水平均低于B4組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);B1組斑塊組織NF-κB、MCP-1、MMP-1、TIMP-1的蛋白表達(dá)水平與B3組水平相當(dāng),差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);B1組斑塊組織NF-κB、MCP-1、MMP-1、TIMP-1的蛋白表達(dá)水平低于B2組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0

13、.05)。
　　 9.Real-timePCR顯示B4組實(shí)驗(yàn)兔斑塊組織IκB、MCP-1、VCAM-1、MMP-1、TIMP-1的mRNA表達(dá)水平高于A組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);B1組、B3組斑塊組織IκB、MCP-1、MMP-1、TIMP-1的mRNA表達(dá)水平低于于B4組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),B3組斑塊組織VCAM-1的mRNA表達(dá)水平低于B4組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),B1組斑塊組織VCA

14、M-1的mRNA表達(dá)水平與B4組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);B1組斑塊組織IκB、MCP-1、MMP-1、TIMP-1的mRNA表達(dá)水平與B3組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);B1組斑塊組織IκB、MMP-1的mRNA表達(dá)水平低于B2組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 10.TUNEL顯示B1組、B2組、B3組實(shí)驗(yàn)兔斑塊局部平滑肌細(xì)胞凋亡率均低于B4組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05):B1組凋亡率稍低