PD-1對動脈粥樣硬化斑塊易損性的影響及機制研究.pdf

1、研究背景： 冠心病的病理基礎是動脈粥樣硬化，已經(jīng)證實動脈粥樣硬化是一種慢性反應性炎癥疾病過程。動脈粥樣硬化斑塊在形成和進展中，其性質(zhì)和特點有很大差異。除斑塊體積對血管腔血流有直接影響外，斑塊本身的成分和性質(zhì)對患者臨床表現(xiàn)及預后影響更大。含有較大壞死性脂核、纖維帽薄、炎癥細胞浸潤多的斑塊被稱為易損性斑塊(vulnerableplaque)，這類斑塊炎癥反應程度重，最容易破裂并導致血栓形成，使血流急劇減少或者完全阻斷，是臨床發(fā)生急性

2、冠狀動脈綜合征的主要發(fā)病機制。逆轉(zhuǎn)易損斑塊、促進其消退及/或干預易損斑塊使其向穩(wěn)定型斑塊轉(zhuǎn)化，是防治急性冠脈綜合征的重要措施，也是臨床上目前需要急待解決的關鍵問題。加強對易損性斑塊中炎癥過程啟動和強化機制的研究，對促進易損性斑塊穩(wěn)定并更好地防治急性冠脈綜合征等高危人群，具有顯著的經(jīng)濟和社會效益。在動脈粥樣硬化形成過程中，免疫系統(tǒng)和免疫細胞起到了重要作用。作為動脈粥樣硬化主要危險因素的高脂血癥和高血糖等因素可以引起免疫應答的啟動，已經(jīng)證實

3、與動脈粥樣硬化病變關系密切的抗原有氧化修飾的低密度脂蛋白(Ox-LDL)、熱休克蛋白(Hsp)和β2-糖蛋白Ⅰ(β2-glycoproteinⅠ)。作為主要炎癥細胞之一的T淋巴細胞，表現(xiàn)對動脈粥樣硬化相關抗原的應答反應，促進動脈粥樣硬化的發(fā)生和進展。在動脈粥樣硬化的形成和演變中不同的T淋巴細胞亞群起不同的作用，其中對動脈粥樣硬化發(fā)生起優(yōu)勢作用的T細胞類型是CD4陽性T輔助細胞(Th)。臨床上急性冠脈綜合征的冠脈病理病變以易損性斑塊為主，

4、對斑塊性質(zhì)研究發(fā)現(xiàn)易損性斑塊炎癥程度重，無論是斑塊局部還是全身血循環(huán)Th1和Th2比例均存在不平衡，這導致粥樣斑塊的炎癥加重，使斑塊向不穩(wěn)定趨勢進展。程序性細胞死亡因子1(Programmedcelldeath1，PD-1)是近年來發(fā)現(xiàn)的新的介導負調(diào)控信號的共刺激分子受體，在激活的T細胞、B細胞和一些髓樣細胞上表達。PD-1屬于CD28家族，其配體PD-Ls屬于共刺激分子B7家族，主要有PD-L1(B7-H1)和PD-L2(B7-DC)

5、。PD-L1和PD-L2在巨噬細胞和DCs上均有表達，長期慢性病毒感染可以使T細胞PD-1表達持續(xù)上調(diào)，同時處于功能衰竭狀態(tài)；而用抗體阻斷PD-1則可以使衰竭的T細胞增殖和分泌細胞因子水平的功能均恢復正常。已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn)CD4陽性T淋巴細胞在粥樣硬化斑塊中表達，其中PD-1表達情況如何尚了解甚少，對PD-1進行阻斷性干預，對形成粥樣硬化斑塊模型體內(nèi)T淋巴細胞功能以及對斑塊易損性的影響，也不清楚。本實驗用免疫組化方法檢測粥樣斑塊形成中PD

6、-1的表達水平，然后用抗PD-1抗體干預，評價CD4陽性細胞功能的變化和對粥樣斑塊性質(zhì)的影響。 研究方法： 本研究分三部分： 第一部分：選取不同類型的冠心病人55例(不穩(wěn)定型心絞痛31例、穩(wěn)定型心絞痛24例)，用ELISA方法檢測血清ox-LDL及外周血PBMC釋放細胞因子IFN-γ和IL-4水平，同時用流式細胞法檢測外周血CD4+和CD4+PD-1+雙陽性細胞比例，并與正常的對照者進行比較，探討PD-1在CD4

7、陽性T淋巴細胞上的表達與冠心病炎癥程度的關系； 第二部分：取C57BL/6JApoE基因敲除鼠及相同遺傳背景野生型小鼠，喂食高脂飼料，21周后處死小鼠，石蠟包埋血管后作連續(xù)切片，行HE染色及PD-1免疫組化染色，檢測斑塊面積和PD-1表達情況；用辛伐他汀干預以后，觀察斑塊面積和PD-1表達水平的變化； 第三部分：制成動脈粥樣硬化動物模型，然后用抗PD-1抗體干預實驗動物，觀察其粥樣斑塊性質(zhì)的改變，并同時測定在體分離的CD

8、4陽性細胞增殖和分泌細胞因子的能力，探討PD-1/PD-Ls信號途徑對斑塊易損性的影響及可能機制。 結(jié)果： 1.外周血中分離PBMC培養(yǎng)后，其上清中的IFN-γ水平以UA組中最高，超過SA組和對照組，差異有顯著性(P＜0.05)，SA組IFN-γ水平也較對照組高；三組的IL-4值比較則差異不是很明顯；UA組血清中ox-LDL值超過SA組(P＜0.05)，對照組中ox-LDL值最低； 2.SA組和UA組外周血PBM

9、C中CD4+細胞比例均較對照組增高(P＜0.05)，SA組和UA組外周血PBMC中CD4+PD-1+雙陽性細胞比例均較對照組增高(P＜0.05)，其中UA組較SA組增高更明顯差異有顯著性(P＜0.05)，提示隨炎癥程度增高，CD4陽性細胞上PD-1的表達增強； 3.AS模型組可見動脈粥樣硬化斑塊明顯形成，斑塊面積較對照組明顯增大，其粥樣斑塊表達PD-1水平也增高；經(jīng)辛伐他汀治療組，斑塊面積明顯減小，PD-1表達也減弱；

10、4.抗PD-1抗體干預組和AS組均可見血管腔有明顯動脈粥樣硬化斑塊形成，經(jīng)計算二組斑塊面積無顯著性差別。但抗體干預組斑塊中有含脂質(zhì)和壞死細胞的核心，表面纖維帽薄，斑塊中含膠原的量偏少，平均光密度值小，與AS組比較有顯著性差異(P＜0.05)； 5.抗體干預組的斑塊中，免疫熒光檢測有較多的CD4陽性細胞浸潤，抗體干預組CD4陽性細胞平均光密度值較高，與AS組比較有顯著性差異(P＜0.05)； 6.抗體干預組脾臟分離的CD4

11、陽性細胞3H-TdR摻入量明顯較AS組增高，差別具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，提示細胞增殖能力增強；抗體干預組CD4陽性細胞分泌IFN-γ和TNF-α水平明顯較AS組高，與AS組比較有顯著性差異(P＜0.05)。 結(jié)論： 1.在UA患者體內(nèi)，外周血PBMC分泌細胞因子的能力明顯增強，CD4陽性細胞激活的比例也較SA高，提示其炎癥程度重，ox-LDL作為刺激免疫應答的抗原之一，可能是炎癥激活的原因。 2.冠心病患

12、者中，隨炎癥程度增高，CD4+細胞和CD4+PD-1+雙陽性細胞比例均增高,作為負性調(diào)控因子的PD-1表達增強，其作用可能是反饋性抑制CD4+細胞的過度激活。 3.在ApoE基因敲除小鼠，隨動脈粥樣硬化斑塊形成程度加重，PD-1在斑塊的表達增加，經(jīng)辛伐他汀干預后斑塊體積減小，PD-1的表達減少，進一步提示其限制和下調(diào)炎癥的作用。 4.給予抗PD-1抗體后，斑塊內(nèi)膠原減少和CD4陽性細胞浸潤增加，表現(xiàn)易損性增加改變，進一步