UVRAG基因在自噬及心臟結(jié)構(gòu)功能維持中的作用.pdf

1、UVRAG（ultraviolet radiation resistance-associated gene）最初發(fā)現(xiàn)于著色性干皮病細(xì)胞中，它能部分地恢復(fù)該細(xì)胞對(duì)紫外線的耐受。后來(lái) UVRAG被鑒定為一個(gè)腫瘤抑制基因，并且有多種生物學(xué)功能，例如細(xì)胞自噬，細(xì)胞內(nèi)吞和DNA修復(fù)等。近來(lái)，大量的研究增加了對(duì)UVRAG的結(jié)構(gòu)和多種生物學(xué)功能的理解，但是其生理學(xué)功能依然所知甚少。
　　利用piggyBac（PB）轉(zhuǎn)座子插入產(chǎn)生的UVRAG基

2、因敲除小鼠模型，我們研究UVRAG在心臟細(xì)胞自噬和維持心臟形態(tài)和功能中的作用。PB轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)位于UVRAG基因的第十四個(gè)內(nèi)含子，RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PB轉(zhuǎn)座子的插入干擾小鼠心臟組織UVRAG mRNA的表達(dá)。免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，敲除小鼠心臟、肝臟、脾臟、肺、骨骼肌和腦等組織中無(wú)UVRAG蛋白表達(dá)。但UVRAG缺失（UVRAGPB/PB）小鼠依舊可存活，有繁殖能力，發(fā)育正常。
　　免疫印跡結(jié)果顯示UVRAG缺失小鼠心臟中

3、LC3 II蛋白顯著提高，提示其自噬體數(shù)量增加。LC3免疫熒光染色結(jié)果顯示UVRAG缺失心臟細(xì)胞中LC3陽(yáng)性熒光點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)數(shù)量顯著增加。透射電鏡結(jié)果顯示，UVRAG缺失心臟中自噬體數(shù)量顯著增加。自噬體合成增加和自噬清除受損均可導(dǎo)致自噬體數(shù)量增加。免疫印跡顯示UVRAG缺失心臟中p62蛋白含量增加，提示自噬流受損。與野生型相比，UVRAG缺失小鼠心臟LC3 II蛋白水平增加，氯喹（Chloroquine）處理小鼠阻斷自噬體溶酶體融合后，野生

4、型小鼠心臟LC3 II顯著提高，但是UVRAG缺失心臟LC3 II與處理前相比沒(méi)有顯著差異。表明UVRAG缺失心臟中自噬流受損，自噬體清除受阻導(dǎo)致自噬體累積。Western blot結(jié)果顯示UVRAG缺失心臟溶酶體分子標(biāo)記物L(fēng)AMP-1和LAMP-2都顯著增加。在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（MEFs）中，UVRAG的缺失也導(dǎo)致自噬流受損，自噬體數(shù)量增加。
　　在心臟形態(tài)和功能方面，兩月齡和六月齡UVRAG缺失小鼠心臟擁有與野生型小鼠一樣的

5、形態(tài)和功能。但十月齡UVRAG缺失小鼠心臟體積顯著大于野生型對(duì)照組。心臟組織橫截面切片染色顯示，UVRAG缺失小鼠心臟橫截面變大，左心室室腔變大，心室壁變薄。H&E染色結(jié)果揭示，與野生型相比UVRAG缺失小鼠單位視野內(nèi)心肌細(xì)胞數(shù)量較少，單個(gè)心肌細(xì)胞橫截面顯著增加。表明十月齡時(shí)UVRAG缺失小鼠出現(xiàn)心肌肥厚。
　　天狼猩紅染色結(jié)果顯示，十月齡UVRAG缺失小鼠心臟出現(xiàn)間質(zhì)膠原累積。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示，十月齡UVRAG缺失心臟心室

6、重構(gòu)分子標(biāo)記物表達(dá)量顯著升高，例如心鈉素（ANF）和腦鈉肽（BNP）。免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，十月齡UVRAG缺失小鼠心臟組織Bax蛋白水平高于野生型對(duì)照組。TUNEL（Terminal-deoxynucleoitidyl Transferase Mediated Nick End Labeling）檢測(cè)小鼠心臟切片，結(jié)果顯示與野生型相比十月齡UVRAG缺失小鼠心臟細(xì)胞凋亡數(shù)量顯著增加。
　　實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示，十月齡UVRAG

7、缺失心臟促炎性細(xì)胞因子表達(dá)量顯著增加，例如白細(xì)胞介素-6（Interleukin-6，IL-6）和腫瘤壞死因子-α（Tumour necrosis factor-α，TNFα）。免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)結(jié)果顯示UVRAG缺失心臟CD45和CD45R陽(yáng)性信號(hào)顯著增加，表明心臟組織中有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR顯示，十月齡UVRAG缺失小鼠心臟樹(shù)突細(xì)胞分子標(biāo)記物CD11c表達(dá)量顯著高于野生型，單核細(xì)胞趨化因子 MCP-1顯著增加，而巨噬細(xì)

8、胞前體細(xì)胞分子標(biāo)記物F4/80，M1型巨噬細(xì)胞分子標(biāo)記物CD68，M2型巨噬細(xì)胞CD163等均與野生型無(wú)顯著差異。脂多糖（LPS）處理實(shí)驗(yàn)小鼠，誘導(dǎo)產(chǎn)生膿血癥模型，促炎性因子顯著提高，但UVRAG缺失小鼠與野生型小鼠相比無(wú)顯著差異，表明在小鼠心臟中，UVRAG缺失與LPS誘導(dǎo)的促炎性因子的表達(dá)無(wú)直接關(guān)系。
　　超聲心動(dòng)圖結(jié)果顯示，十月齡UVRAG缺失小鼠心臟左心室舒張末期內(nèi)徑（LVEDD）和左心室收縮末期內(nèi)徑（LVESD）顯著增加