IRF-2基因在干擾素-γ影響胰腺腺泡細(xì)胞炎癥反應(yīng)與自噬活性中的作用研究.pdf

1、目的：
　?。?）觀察IFN-γ對(duì)AR42J細(xì)胞急性胰腺炎過(guò)程中細(xì)胞上清IL-1、IL-6、TNF-α及AMS等炎癥因子的影響，以及凋亡與自噬作用的改變；并探討自噬改變對(duì)AR42J細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響及IRF-2基因的改變，初步探討自噬機(jī)制在急性胰腺炎中的作用和意義。
　?。?）通過(guò)構(gòu)建IRF-2基因下調(diào)的細(xì)胞模型為研究對(duì)象，以轉(zhuǎn)染陰性載體的AR42J細(xì)胞作為陰性載體對(duì)照組（IRF2-NC），探討IRF-2蛋白表達(dá)改變對(duì)AR4

2、2J細(xì)胞自噬作用與炎癥反應(yīng)的影響，從自噬調(diào)控角度探討IRF-2基因在急性胰腺炎發(fā)生機(jī)制中的作用。
　　方法：
　?。?）采用不同濃度梯度的IFN-γ預(yù)處理AR42J細(xì)胞，雨蛙素刺激制備急性胰腺炎細(xì)胞模型，采用ELISA方法檢測(cè)檢測(cè)各組細(xì)胞上清IL-1、IL-6、TNF-α及AMS的濃度，Western blot方法檢測(cè)活化的cleaved Caspase3與Caspase9蛋白的表達(dá)。
　?。?）采用不同濃度梯度的IF

3、N-γ預(yù)處理AR42J細(xì)胞，雨蛙素刺激制備急性胰腺炎細(xì)胞模型，采用透射電鏡的方法觀察細(xì)胞內(nèi)自噬體形成情況。采用Western blot方法檢測(cè)自噬調(diào)控基因LC3II/I、Beclin1、LAMP2、Cathepsin B表達(dá)的改變。
　?。?）采用自噬抑制劑3-MA預(yù)處理AR42J細(xì)胞，然后加入雨蛙素至細(xì)胞中制備急性胰腺炎細(xì)胞模型，采用Western blot方法檢測(cè)自噬調(diào)控基因LC3II/I、Beclin1表達(dá)的改變。采用ELI

4、SA方法檢測(cè)檢測(cè)各組細(xì)胞上清中IL-1、IL-6、TNF-α及AMS的濃度，并采用Western blot方法檢測(cè)IRF-2表達(dá)的改變。
　　（4）采用慢病毒轉(zhuǎn)染的方式構(gòu)建IRF-2基因表達(dá)下調(diào)的AR42J細(xì)胞株，應(yīng)用RT-PCR與Western blot方法對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行鑒定，以轉(zhuǎn)染陰性載體的AR42J細(xì)胞作為陰性載體對(duì)照組（IRF2- NC），采用雨蛙素造模的方法至以上構(gòu)建的各組細(xì)胞中制備急性胰腺炎細(xì)胞模型，采用Western

5、 blot方法檢測(cè)自噬調(diào)控基因LC3II/I、Beclin1及IRF-2蛋白表達(dá)的改變。采用ELISA方法檢測(cè)檢測(cè)各組細(xì)胞上清中IL-1、IL-6、TNF-α及AMS的濃度。
　　結(jié)果：
　　（1）ELISA方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，未采用IFN-γ預(yù)處理的細(xì)胞炎癥因子大量釋放，而當(dāng)IFN-γ濃度依次升高時(shí)，各組細(xì)胞上清IL-1、IL-6、TNF-α及AMS的濃度逐漸下降，濃度值均明顯低于對(duì)照組細(xì)胞（P<0.05）。采用Western

6、blot方法檢測(cè)活化的cleaved Caspase3與Caspase9蛋白的表達(dá)結(jié)果，活化的cleaved caspase3與Caspase9蛋白在以上各組均無(wú)表達(dá)，無(wú)明顯差異。
　?。?）采用透射電鏡的方法觀察發(fā)現(xiàn)，急性胰腺炎初期，采用IFN-γ預(yù)處理細(xì)胞中自噬小體數(shù)量明顯增加，自噬小體數(shù)量明顯高于對(duì)照組。當(dāng)IFN-γ濃度依次升高時(shí)，LC3II/I、Beclin1、LAMP2、Cathepsin B表達(dá)逐漸升高，均明顯高于對(duì)照

7、組細(xì)胞。
　?。?）3-MA對(duì)細(xì)胞內(nèi)自噬具有抑制作用；當(dāng)自噬機(jī)制受抑制時(shí)，IL-1、IL-6、TNF-α及AMS細(xì)胞炎性因子釋放增加。當(dāng)IFN-γ濃度依次升高時(shí)，IRF-2表達(dá)逐漸升高。
　　（4）采用慢病毒轉(zhuǎn)染的方式構(gòu)建IRF-2基因表達(dá)下調(diào)的AR42J細(xì)胞株并應(yīng)用RT-PCR與Western blot方法鑒定。當(dāng)IRF-2蛋白表達(dá)下調(diào)后，LC3II/I、Beclin1蛋白表達(dá)在急性胰腺炎組明顯降低；當(dāng)自噬機(jī)制受抑制時(shí)，各

8、組細(xì)胞炎癥反應(yīng)增強(qiáng)，上清中IL-1、IL-6、TNF-α及AMS等炎性因子釋放增加。
　　結(jié)論：
　　（1）IFN-γ可能對(duì)AR42J細(xì)胞具有抑制炎性反應(yīng)的作用，該作用可能通過(guò)增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)自噬活性實(shí)現(xiàn)。自噬機(jī)制對(duì)AR42J細(xì)胞炎性反應(yīng)具有保護(hù)作用，干擾素調(diào)節(jié)因子IRF-2可能參與細(xì)胞自噬機(jī)制的調(diào)控及炎癥反應(yīng)的變化過(guò)程。
　?。?）當(dāng)IRF-2蛋白表達(dá)下調(diào)后，LC3II/I、Beclin1自噬相關(guān)蛋白表達(dá)明顯降低；當(dāng)自噬機(jī)