急性胰腺炎時自噬變化的意義及干擾素γ對自噬影響的實驗研究.pdf

1、研究背景：
　　 急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)是臨床常見的急癥，國外報告其發(fā)病率10/105～44/105，近年來呈升高趨勢。約20％患者可發(fā)展為重癥急性胰腺炎，病死率高達15％～30％，病情危重，預后兇險，已經(jīng)成為威脅人類健康和生命的重要殺手。盡管國內(nèi)外學者對急性胰腺炎的防治進行了多年的研究，但迄今還沒有針對急性胰腺炎特效的防治措施，其原因與目前對急性胰腺炎的發(fā)病機制認識不夠深入有關(guān)。因此，深入研究

2、急性胰腺炎的發(fā)病機制，探索急性胰腺炎啟動的關(guān)鍵過程，不僅具有重要的學術(shù)價值，而且將有助于尋找和建立有針對性的救治方法，以期提高急性胰腺炎的救治水平，具有重要的的意義。
　　 自噬是廣泛存在于真核生物中的生命現(xiàn)象，屬程序性細胞死亡的一種。自噬發(fā)生時，在細胞內(nèi)形成“雙層膜”結(jié)構(gòu)的囊泡即自噬體，包裹胞質(zhì)成分和某些細胞器碎片，送入溶酶體中并進行多種酶的消化及降解，為細胞內(nèi)再循環(huán)提供能量和小分子物質(zhì)。自噬是急性胰腺炎早期發(fā)生的事件，在急性

3、胰腺炎中的作用機制存在很多爭議。有學者采用敲除自噬相關(guān)基因小鼠研究后發(fā)現(xiàn)急性胰腺炎減輕，同時自噬相關(guān)蛋白減少，推測自噬在急性胰腺炎中被誘導增強，自噬對胰腺起損害作用;有學者研究發(fā)現(xiàn)在急性胰腺炎中長壽蛋白的降解大大減少（長壽蛋白通過自噬途徑降解），大量空泡聚集，認為自噬在急性胰腺炎中下降，自噬對胰腺起保護作用;另外有學者認為自噬是一個動態(tài)的過程，自噬過程在急性胰腺炎中被破壞，自噬和胰腺炎起相互促進作用。這些相互矛盾結(jié)果顯示自噬在急性胰腺炎

4、發(fā)生中存在很大的爭議。
　　 干擾素γ是一種來自T淋巴細胞培養(yǎng)液上清的蛋白，具有免疫調(diào)節(jié)和抗細胞增殖作用。目前有研究發(fā)現(xiàn)干擾素γ可促進自噬。另有文獻報告干擾素γ對急性胰腺炎有一定影響。為了進一步探討自噬在急性胰腺炎發(fā)生過程中的變化及其病理意義，并觀察干擾素γ對急性胰腺炎及自噬的影響，并探討其作用機制，擬開展本實驗研究。
　　 研究目標：
　　 1.建立大鼠重癥急性胰腺炎模型。觀察急性胰腺炎發(fā)生過程中自噬活性的變化

5、，探討其病理意義。
　　 2.觀察干擾素γ對急性胰腺炎炎癥及自噬的影響，初步探討其機制。
　　 研究方法：
　　 圍繞上述目標，本研究采用以下研究方法:
　　 1.動物模型的建立
　　 采用左旋精氨酸400mg/100g（腹腔注射，2次，間隔1小時）方法，構(gòu)建急性胰腺炎大鼠模型。
　　 2.電鏡
　　 大鼠新鮮胰腺組織取下后立即置于25％戊二醛電鏡固定液中，切成1mm3大小組織塊，

6、送電鏡室，于透射電鏡下觀察自噬相關(guān)結(jié)構(gòu)。
　　 3.ELISA
　　 大鼠麻醉開腹后，心臟取血2～5ml置于抗凝管內(nèi)，靜止2h后，3000rpm離心5min，取上清，置于-80℃冰箱低溫凍存待測。檢測時于4℃靜置解凍，用R&D試劑盒行ELISA檢測，檢測不同時間點AMY、TAP的濃度及IL-1、IL-6、TNF-α等炎癥因子的水平。
　　 4.HE染色
　　 標本置于4％中性緩沖甲醛中固定24小時，組織脫

7、水石蠟包埋，室溫保存，行HE染色后觀察胰腺炎癥程度。
　　 5.免疫組化
　　 經(jīng)漂洗，封閉，一抗和二抗孵育后檢測LC3、Beclin-1、Lamp-2等蛋白在胰腺組織中的表達。
　　 6.Western Blot
　　 經(jīng)過提取蛋白、凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、標記一抗和二抗、曝光等步驟觀察LC3、Beclin-1、Lamp-2、GAPDH等蛋白的表達。
　　 7.qRT-PCR
　　 通過RNA提

8、取、逆轉(zhuǎn)錄和qRT-PCR的方法檢測胰腺組織LC3、Beclin-1、Lamp-2、Ⅲ型PI3K、GAPDH等蛋白的基因表達。
　　 8.統(tǒng)計學分析
　　 全部數(shù)據(jù)通過SPSS11.5統(tǒng)計軟件進行分析，取P＜0.05具有統(tǒng)計學意義。計量資料實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（(x)±S）表示;兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗，多組樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，方差齊時采用LSD-t或SNK-q檢驗，方差不齊時

9、采用Dunnett's T3或Dunnett's C檢驗。
　　 研究結(jié)果：
　　 1.20％L-精氨酸腹腔注射可構(gòu)建重癥急性胰腺炎模型
　　 先后采用250mg/100g、300mg/100g、400mg/100g和500mg/100g等不同給藥劑量的20％L-精氨酸腹腔注射構(gòu)建重癥急性胰腺炎大鼠模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)400mg/100g的劑量腹腔注射2次，間隔1小時造模，可成功建立重癥急性胰腺炎大鼠模型。
　　

10、 2.急性胰腺炎誘導增強自噬的發(fā)生
　　 免疫組化、Western Blot和qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，與正常對照組比較，大鼠急性胰腺炎模型組自噬相關(guān)因子LC3、Beclin-1的蛋白與mRNA表達顯著上調(diào);電鏡觀察發(fā)現(xiàn)急性胰腺炎組大鼠胰腺組織自噬相關(guān)超微結(jié)構(gòu)明顯多于對照組。結(jié)果證實急性胰腺炎可誘導增強自噬的發(fā)生。
　　 3.調(diào)控自噬可影響胰蛋白酶原的活化程度和急性胰腺炎的損傷程度
　　 分別采用自噬誘導劑雷帕霉

11、素(RAP)和自噬阻斷劑氯喹(CQ)及3-甲基腺嘌呤(3-MA)調(diào)控自噬活性，發(fā)現(xiàn)誘導自噬后TAP明顯升高，阻斷自噬后TAP下降;SAP9h后誘導劑組大鼠胰腺壞死病理評分高于急性胰腺炎組，阻斷劑組與急性胰腺炎組無明顯差別，24h后誘導劑組胰腺壞死評分高于急性胰腺炎組，阻斷劑組胰腺壞死評分低于急性胰腺炎組。結(jié)果表明急性胰腺炎時自噬可促進胰蛋白酶原的激活，并參與胰腺的損傷。
　　 4.干擾素γ在急性胰腺炎時可誘導自噬的發(fā)生及自噬體和

12、溶酶體的融合
　　 與急性胰腺炎對照組相比，急性胰腺炎模型大鼠注射干擾素γ，免疫組化、Western Blot和qRT-PCR檢測均表明自噬相關(guān)因子LC3及Beclin-1的蛋白和mRNA表達明顯上調(diào);溶酶體相關(guān)膜蛋白-2(Lamp-2)蛋白和基因表達亦明顯上調(diào)。結(jié)果表明干擾素γ可進一步誘導自噬的發(fā)生，并促進自噬體和溶酶體的融合。
　　 5.干擾素γ能促進胰蛋白酶原的激活和加重急性胰腺炎時胰腺的損傷
　　 與急性

13、胰腺炎對照組相比，急性胰腺炎模型大鼠注射干擾素γ后胰腺水腫、炎癥、壞死、出血評分明顯增高;血漿炎癥因子IL-6濃度明顯升高，TAP在各時間點均明顯上升;淀粉酶峰值前移。結(jié)果表明干擾素γ能促進胰蛋白酶原的激活，并加重急性胰腺炎時的炎癥反應與胰腺損傷。
　　 6.急性胰腺炎時干擾素γ可能通過Ⅲ型PDK通路來誘導自噬和加重炎癥
　　 qRT-PCR顯示干擾素γ組Ⅲ型PI3K復合物(vps34) mRNA明顯高于急性胰腺炎對照組