小分子化合物EX-ACEA-0010MA抗急性髓細(xì)胞白血病的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、第一部分:EX-ACEA-0010MA對(duì)急性髓細(xì)胞白血病(AML)細(xì)胞株的作用。
　　目的:
　　探索EX-ACEA-0010MA對(duì)AML細(xì)胞株的生長(zhǎng)抑制、周期阻滯、誘導(dǎo)凋亡以及抑制集落形成的作用，為下一步研究作用機(jī)制打下基礎(chǔ)。
　　方法:
　　應(yīng)用MTT法檢測(cè)EX-ACEA-0010MA對(duì)AML細(xì)胞株和人正常的肝細(xì)胞株L02細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用，并與已有的布魯頓酪氨酸激酶抑制劑Ibrutinib進(jìn)行比較;集落培養(yǎng)

2、法、AnnexinⅤ/PI雙染法和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)EX-ACEA-0010MA作用AML細(xì)胞株細(xì)胞后細(xì)胞的集落形成能力、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期情況;Hoechst33258染色法觀察EX-ACEA-0010MA誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化。
　　結(jié)果:
　　(1)不同濃度的EX-ACEA-0010MA作用于AML細(xì)胞株U937、KG-1以及正常肝細(xì)胞L02后，前兩者24h的半數(shù)致死率(IC50)分別為1.05μM和6.48μ M;48

3、h的IC50值分別為0.34μM和4.78μM，而對(duì)L02細(xì)胞株無(wú)明顯殺傷作用。說(shuō)明該藥物對(duì)正常細(xì)胞毒副作用較小。不同濃度的Ibrutinib作用于AML細(xì)胞株U937、KG-1和L02細(xì)胞后，前兩者24h的IC50分別為19.46μM和44.97μM;48h的IC50值分別為8.08μM和9.30μM。(2)將1.25μM的EX-ACEA-0010MA和20μM的Ibrutinib分別作用于L02細(xì)胞24h后發(fā)現(xiàn)EX-ACEA-001

4、0MA對(duì)正常肝臟細(xì)胞L02的毒性作用明顯比Ibrutinib低(p＜0.001)。(3)EX-ACEA-0010MA作用于U937和KG-1后，隨著藥物濃度的增加，抑制其集落形成的現(xiàn)象更加明顯。(4)EX-ACEA-0010MA對(duì)U937和KG-1均有誘導(dǎo)凋亡的作用。(5)EX-ACEA-0010MA對(duì)U937有明顯的周期阻滯，1.25μM藥物作用24h后能明顯阻滯G0/G1期。但在藥物對(duì)KG-1的IC50濃度時(shí)，其對(duì)KG-1周期阻滯作

5、用不明顯。(6)分別以1.25μM和10μM的EX-ACEA-0010MA作用于U937和KG-1細(xì)胞株24h后，經(jīng)Hoechst33258染色法染色后，可發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)明顯的凋亡小體，進(jìn)而從形態(tài)學(xué)上證明了EX-ACEA-0010MA可以誘導(dǎo)AML細(xì)胞發(fā)生凋亡。
　　結(jié)論:
　　(1) EX-ACEA-0010MA對(duì)AML細(xì)胞株的增殖抑制作用比Ibrutinib的作用強(qiáng)，并且對(duì)正常對(duì)照細(xì)胞L02無(wú)明顯殺傷作用，

6、比Ibrutinib更具有安全性。(2)EX-ACEA-0010MA具有顯著地抑制集落形成能力和促進(jìn)細(xì)胞凋亡能力，并且對(duì)U937細(xì)胞株有明顯的周期阻滯能力。
　　第二部分:EX-ACEA-0010MA抗急性髓細(xì)胞白血病的作用機(jī)制
　　目的:
　　探索EX-ACEA-0010MA對(duì)AML細(xì)胞株的作用機(jī)制
　　方法:
　　應(yīng)用Western Blot法檢測(cè)EX-ACEA-0010MA作用U937、KG-1細(xì)胞株

7、細(xì)胞后檢測(cè)BTK、p-BTK、PI3K/AKT通路蛋白，Caspase家族蛋白和BCL2家族蛋白的表達(dá)變化以及G1/S期檢測(cè)點(diǎn)周期依賴性激酶CDK2、CDK4和CDK6;免疫熒光檢測(cè)EX-ACEA-0010MA作用U937、KG-1細(xì)胞株細(xì)胞后p-NF-κB(p-P65)的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　(1) Western Blot檢測(cè)顯示EX-ACEA-0010MA作用后U937和KG-1細(xì)胞中p-BTK蛋白的含量明顯降低而總

8、的BTK蛋白沒(méi)有明顯改變。(2)PI3K/AKT通路中關(guān)鍵蛋白PI3K(p110)和p-AKT以及下游的p-IKK均隨著藥物濃度的增高而降低。
　　(3) Caspase3、Caspase8和PARP均有明顯激活，而Caspase9沒(méi)有明顯激活且BCL2家族蛋白均沒(méi)有明顯變化。GO/G1期檢測(cè)點(diǎn)蛋白CDK2、CDK4和CDK6的表達(dá)均有下降。(4)用10μM的EX-ACEA-0010MA作用U937、KG-1細(xì)胞株細(xì)胞后經(jīng)免疫熒光

9、法鏡下觀察發(fā)現(xiàn)p-P65的表達(dá)及入核較對(duì)照組減少。
　　結(jié)論:
　　(1) EX-ACEA-0010MA通過(guò)抑制PI3K/AKT通路，從而抑制下游p-P65的表達(dá)，阻止其入核發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子作用而實(shí)現(xiàn)其促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用。(2)EX-ACEA-0010MA可通過(guò)抑制周期蛋白依賴性激酶CKD2、CDK4和CDK6的表達(dá)，阻止白血病細(xì)胞進(jìn)入S期，從而阻止白血病細(xì)胞DNA的復(fù)制。(3)EX-ACEA-0010MA誘導(dǎo)AML細(xì)胞株凋亡的