高三尖杉酯堿抗急性髓系白血病作用的分子靶標(biāo)鑒定及其作用機(jī)制研究.pdf

1、研究背景:
　　高三尖杉堿酯（Homoharringtonine，cephalotaxine，4-methyl2-hydroxy-4-meth-ylpentyl butanedioate[ester]，簡稱HHT，別名高粗榧堿）是從我國特有三尖杉屬植物海南粗榧（Cephalotaxus harringtonia）（常綠喬木）中分離得到的天然生物堿，在納摩爾（nanomolar concentration，nM）濃度就能殺傷腫瘤細(xì)胞

2、，是一種非常有效的抗癌劑。在中國，HHT被用來作為急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML)聯(lián)合化療方案的一個(gè)關(guān)鍵組成部分，廣泛使用已經(jīng)超過30年。
　　最近的一項(xiàng)多中心、開放、隨機(jī)對照的Ⅲ期臨床試驗(yàn)顯示，對于原發(fā)性AML患者，基于HHT的誘導(dǎo)方案HAA（高三尖杉酯堿+阿糖胞苷+阿柔比星）取得了較高(73％)的完全緩解率(complete remission rate，CR)，顯著高于目前治療AML的

3、國際標(biāo)準(zhǔn)方案（柔紅霉素聯(lián)合阿糖胞苷）的57.3％;并且其3年無事件生存率(3-yearevent-free survival)為35.4％比23.1％，從而成為原發(fā)性AML的標(biāo)準(zhǔn)誘導(dǎo)緩解方案。然而，臨床上不同白血病患者對HHT的治療反應(yīng)是迥然不同的。HHT對部分患者有良好的治療效果，能達(dá)到完全緩解，但也有一部分患者不但沒有收到療效，甚至出現(xiàn)了骨髓抑制等嚴(yán)重后果。因此，尋找HHT抗白血病作用的分子靶標(biāo)，并闡明其作用的具體分子機(jī)制無疑有助于

4、最大限度發(fā)揮HHT抗白血病作用并減少HHT相關(guān)的毒副作用。
　　以往一些研究認(rèn)為核糖體是HHT介導(dǎo)的蛋白質(zhì)翻譯抑制的候選靶標(biāo)之一，其主要依據(jù)是晶體結(jié)構(gòu)研究。該研究顯示HHT與氨基酸側(cè)鏈的氨?；?tRNA相競爭，結(jié)合在核糖體的肽基轉(zhuǎn)移酶中心的A位。然而，在此共結(jié)晶結(jié)構(gòu)模型中使用的HHT濃度為1毫摩爾(mM)，這是HHT用于殺傷腫瘤細(xì)胞nM濃度的10萬倍，提示HHT結(jié)合到核糖體的親和力可能不高。不排除在這一高濃度下，HHT非特異性結(jié)合

5、到核糖體的可能。此外，如果核糖體是HHT的一個(gè)關(guān)鍵靶標(biāo)，HHT處理后應(yīng)抑制全部蛋白質(zhì)的合成。然而，文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)HHT選擇性地抑制一些半衰期短的致癌蛋白的合成，如c-Myc，cyclin-D1，Mcl-1等，但對管家基因編碼的蛋白質(zhì)，如GAPDH和β-actin并沒有明顯影響，這是核糖體作為HHT的主要靶分子所不能解釋的。因此，我們推測尚有未知的關(guān)鍵的分子靶標(biāo)可能參與HHT介導(dǎo)的抗腫瘤活性。
　　文獻(xiàn)報(bào)道指出，真核翻譯起始因子4E(

6、eukaryotic translation initiation factor4E，eIF4E)在具有短半衰期的致癌蛋白或者促生存蛋白的mRNAs轉(zhuǎn)運(yùn)過程中發(fā)揮了關(guān)鍵性的作用;并且在AML-M5患者中eIF4E過表達(dá)。巧合的是，我們最近的研究發(fā)現(xiàn)p-eIF4E水平在AML-M5患者中高度上調(diào)。結(jié)合既往的研究結(jié)果，使我們有理由相信HHT可能通過作用于p-eIF4E發(fā)揮抑制白血病細(xì)胞增殖的作用。
　　本研究中，我們首先應(yīng)用生物素標(biāo)記

7、的HHT分離和鑒定可能與HHT作用的eIF4E和p-eIF4E蛋白質(zhì)分子靶標(biāo)，然后通過系列體外和小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)手段和方法系統(tǒng)研究HHT與其靶標(biāo)之間相互作用的分子機(jī)制，為明確HHT臨床應(yīng)用的適應(yīng)癥提供科學(xué)理論依據(jù)。
　　研究目的:
　　1、分離和鑒定高三尖杉堿酯抗急性髓系白血病作用的分子靶標(biāo);
　　2、初步闡明高三尖杉堿酯與其分子靶標(biāo)p-eIF4E相互作用的分子機(jī)制;
　　3、明確高三尖杉堿酯對高表達(dá)分子靶標(biāo)p-eI

8、F4E的人急性髓系白血病細(xì)胞在小鼠體內(nèi)的生長抑制作用;
　　4、明確高三尖杉堿酯分子靶標(biāo)p-eIF4E在人髓系白血病原代樣本及正常血細(xì)胞樣本中的表達(dá)情況。
　　研究內(nèi)容與結(jié)果:
　　1.p-eIF4E是HHT抗急性髓系白血病活性的一個(gè)關(guān)鍵靶標(biāo)
　　為了明確HHT是否特異性地影響AML細(xì)胞中的p-eIF4E水平，通過Westernblotting檢測HHT對p-eIF4E和t-eIF4E的作用。用HHT處理AML-

9、M5細(xì)胞系THP-1白血病細(xì)胞24小時(shí)導(dǎo)致p-eIF4E水平的抑制，呈劑量依賴，而t-eIF4E水平則不受影響。同樣，在原代AML細(xì)胞中也觀察到了類似結(jié)果。并且HHT對p-eIF4E水平的影響呈時(shí)間依賴。為觀察HHT是否存在抑制其他信號分子的脫靶效應(yīng)，我們檢測HHT對MNK1和Mcl-1的抑制作用。在顯著抑制eIF4E磷酸化的濃度，HHT對磷酸化的MNK1沒有明顯的影響，而Mcl-1的水平則表現(xiàn)出與p-eIF4E平行的下降，表明p-eI

10、F4E水平的下降不是非特異性毒性作用的結(jié)果。上述結(jié)果有力地表明HHT特異性地降低p-eIF4E及其下游靶蛋白Mcl-1。
　　為了評估HHT介導(dǎo)的p-eIF4E的減少是否與其抗白血病活性有關(guān)，通過MTT試驗(yàn)和Western blotting技術(shù)來研究細(xì)胞存活率和p-eIF4E蛋白下降的關(guān)系。我們用一定濃度的HHT作用THP-1細(xì)胞48小時(shí)，可以觀察到HHT介導(dǎo)的抗白血病活性和p-eIF4E抑制呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.87。為了進(jìn)一

11、步證實(shí)上述結(jié)果，接下來我們選擇了6個(gè)具有不同的抑制細(xì)胞增殖能力的HHT結(jié)構(gòu)類似物，分別檢測其在THP-1細(xì)胞的抗增殖活性和p-eIF4E的抑制作用，發(fā)現(xiàn)HHT類似物抗細(xì)胞增殖的IC50值和p-eIF4E的抑制是顯著相關(guān)的，相關(guān)系數(shù)為0.98。這些結(jié)果強(qiáng)有力地說明HHT可能是抑制白血病細(xì)胞生長的特異的p-eIF4E的拮抗劑。
　　2.HHT特異性下調(diào)白血病細(xì)胞p-eIF4E水平
　　為了確認(rèn)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們采用生物素標(biāo)記的H

12、HT(HHT-biotin)來捕獲白血病細(xì)胞中的p-eIF4E蛋白和eIF4E蛋白。采用THP-1細(xì)胞的全細(xì)胞裂解產(chǎn)物與HHT-biotin孵育，然后用親和素磁珠來沉淀與HHT-biotin相互作用的蛋白分子復(fù)合物。經(jīng)過充分的洗滌，在沉淀產(chǎn)物中檢測到p-eIF4E和t-eIF4E。與此相一致的是，我們通過SDS-PAGE和考馬斯亮藍(lán)染色實(shí)驗(yàn)檢測到p-eIF4E蛋白條帶，并通過Western blotting和蛋白質(zhì)譜分析(Mass Sp

13、ectroscopic analysis)得到確認(rèn)。為了檢測純化的p-eIF4E蛋白是否與HHT相互作用，進(jìn)一步通過pull-down實(shí)驗(yàn)證實(shí)HHT-biotin是結(jié)合到p-eIF4E蛋白的。
　　為了揭示在白血病細(xì)胞中HHT結(jié)合p-eIF4E的細(xì)胞定位，用生物素標(biāo)記的HHT(HHT-biotin)、生物素(biotin)和HHT作用THP-1細(xì)胞12小時(shí)，通過p-eIF4E抗體的免疫熒光染色，觀察其與HHT-biotin的共定位

14、情況。結(jié)果顯示HHT-biotin在整個(gè)細(xì)胞漿和細(xì)胞核內(nèi)均有分布，但主要定位于核p-eIF4E。
　　為了進(jìn)一步驗(yàn)證上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們用HHT(100 ng/ml)作用THP-1細(xì)胞12h或者24 h，通過免疫熒光染色來評估p-eIF4E和t-eIF4E在白血病細(xì)胞的分布。結(jié)果顯示HHT作用12小時(shí)，核p-eIF4E水平大大減少，在24小時(shí)基本消失，但t-eIF4E無明顯影響。并且我們還觀察到，伴隨核p-eIF4E的消失，HHT促

15、進(jìn)核p-eIF4E在細(xì)胞核周邊和胞漿的聚集。Western blotting實(shí)驗(yàn)也顯示HHT作用能顯著降低THP-1細(xì)胞核p-eIF4E水平。這些研究結(jié)果表明，在白血病細(xì)胞，HHT主要結(jié)合于p-eIF4E，特別是核p-eIF4E。
　　3.p-eIF4E209位磷酸化絲氨酸是HHT結(jié)合的關(guān)鍵位點(diǎn)之一
　　為了揭示HHT結(jié)合p-eIF4E的潛在結(jié)合位點(diǎn)，通過計(jì)算機(jī)分子對接模型，我們發(fā)現(xiàn)201a.a.到212a.a.是HHT結(jié)合

16、eIF4E的關(guān)鍵位點(diǎn)。我們模擬了25納秒(ns)時(shí)磷酸化S209(p-eIF4E)、磷酸化S209-敲除(eIF4E-Δ209S)與HHT的相互作用，結(jié)果顯示為了獲得更強(qiáng)的蛋白-配體相互作用，p-eIF4E中的環(huán)區(qū)移向HHT分子，K206的重要組成部分氧原子與HHT分子形成氫鍵。另一方面，在eIF4E-Δ209S內(nèi)的環(huán)區(qū)因?yàn)榫植柯菪男纬啥テ潇`活性，因此它與HHT分子的結(jié)合力是比較弱的。這可以通過檢查環(huán)區(qū)與HHT的最小距離來進(jìn)一步說

17、明。模擬p-eIF4E、eIF4E和eIF4EΔ209S在0-25ns與HHT的相互作用，我們發(fā)現(xiàn)這個(gè)環(huán)區(qū)是靈活的，并且最終在17ns時(shí)p-eIF4E與HHT形成緊密而穩(wěn)定的作用，兩者的最小距離為2.8(A);然而對于eIF4E-Δ209S的模擬顯示，該環(huán)區(qū)始終遠(yuǎn)離HHT分子，距離達(dá)到8(A);對于eIF4E，也沒有觀察到其與HHT穩(wěn)定的相互作用。上述分子對接模型結(jié)果表明，相比于eIF4E-Δ209S和eIF4E，p-eIF4E蛋白對H

18、HT具有更大的親和力。
　　為了鑒定HHT結(jié)合eIF4E的具體氨基酸位點(diǎn)，我們構(gòu)建了一系列eIF4E的突變體，包括W56，W73，W102和Ser209缺失的突變體，通過轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞檢測HHT結(jié)合到這些突變體的能力。選擇這些突變體的主要原因是W73與泛素/降解相關(guān)，W56和W102涉及帽結(jié)合活性，而S209則是其磷酸化位點(diǎn)。結(jié)果顯示，Ser209缺失的突變體消除了eIF4E與HHT的結(jié)合，這與上述計(jì)算機(jī)模擬結(jié)果一致，而其他

19、氨基酸殘基的突變，包括eIF4E56W，73W和102W缺失，并不影響eIF4E與HHT的結(jié)合。這些結(jié)果表明磷酸化Ser209位點(diǎn)是HHT結(jié)合eIF4E的關(guān)鍵，并且p-eIF4E與HHT結(jié)合的親和力遠(yuǎn)高于eIF4E。
　　4.HHT通過增加SUMO化促進(jìn)蛋白酶體依賴的p-eIF4E蛋白降解
　　已知eIF4E是小泛素化蛋白(SUMO)底物之一。為明確SUMO化修飾是否參與HHT介導(dǎo)的p-eIF4E的下降，我們評估了白血病細(xì)胞

20、中HHT對p-eIF4E和SUMO結(jié)合酶UBC9的影響。結(jié)果顯示，HHT處理THP-1細(xì)胞3小時(shí)，p-eIF4E從細(xì)胞裂解液的上清轉(zhuǎn)移到不溶性顆粒，伴隨出現(xiàn)UBC9的增加。HHT處理24小時(shí)后，大部分的p-eIF4E從上清液轉(zhuǎn)移到不溶性顆粒，提示HHT增加p-eIF4E在髓系白血病細(xì)胞中的變性水平。這些結(jié)果與免疫熒光觀察到的結(jié)果即HHT誘導(dǎo)p-eIF4E在細(xì)胞核周邊和胞漿的聚集相一致。進(jìn)一步，我們發(fā)現(xiàn)蛋白酶體抑制劑MG132強(qiáng)烈阻止白血

21、病細(xì)胞中HHT誘導(dǎo)的p-eIF4E蛋白水平的下降，提示HHT可能觸發(fā)p-eIF4E的蛋白酶體依賴的降解。
　　接下來我們研究HHT是否通過增加SUMO化使p-eIF4E變性？使用HEK293細(xì)胞轉(zhuǎn)染表達(dá)FALG-eIF4E、FALG-eIF4E-Δ209S的質(zhì)粒，然后用/不用HHT處理12h。細(xì)胞裂解物用抗FALG M2磁珠進(jìn)行免疫沉淀，隨后用anti-SUMO1、anti-SUMO2/3或者anti-FALG抗體通過wester

22、n blotting技術(shù)進(jìn)行分析。結(jié)果顯示:HHT處理后，用anti-SUMO2/3抗體檢測，發(fā)現(xiàn)野生型eIF4E在25 kDa以上有多條條帶，但是在eIF4E-Δ209S突變卻未檢測到;而且無法用anti-SUMO1抗體檢測到上述條帶，并且HHT(100 ng/ml)增加了SUMO化p-eIF4E的寡聚化。這些結(jié)果表明HHT處理增加了SUMO2/3介導(dǎo)的p-eIF4E的SUMO化。
　　此外，Ser209的磷酸化是HHT介導(dǎo)的p

23、-eIF4E的SUMO化的關(guān)鍵。為了進(jìn)一步明確上述結(jié)果，在白血病細(xì)胞中，我們對HHT誘導(dǎo)的UBC9結(jié)合到p-eIF4E的水平做進(jìn)一步的分析，發(fā)現(xiàn)HHT增加UBC9結(jié)合到p-eIF4E，呈時(shí)間依賴。這些結(jié)果表明，HHT誘導(dǎo)SUMO2/3分子介導(dǎo)的p-eIF4E蛋白的SUMO化，通過增加UBC9與p-eIF4E的親和力，這反過來導(dǎo)致p-eIF4E蛋白酶體依賴的降解。因此，我們提出HHT誘導(dǎo)p-eIF4E降解的工作模型:HHT特異性結(jié)合到p-

24、eIF4E的201-212a.a.，導(dǎo)致構(gòu)象變化，這有利于p-eIF4E的寡聚化和SUMO化，最終導(dǎo)致蛋白酶體依賴的降解。
　　5.HHT對p-eIF4E高表達(dá)的人AML-M5原位小鼠移植瘤的生長抑制作用
　　為了獲得HHT根除p-eIF4E高表達(dá)的AML細(xì)胞的體內(nèi)證據(jù)，我們把表達(dá)高水平p-eIF4E的THP-1細(xì)胞注射到NSG小鼠體內(nèi)，建立了具有侵襲性的人AML-M5原位小鼠模型。每天按0.5mg或1.0mg/kg體重的H

25、HT劑量腹腔給藥，1天1次，連續(xù)14天。經(jīng)過HHT處理大大降低了白血病負(fù)荷，并且生存時(shí)間延長，呈現(xiàn)劑量依賴。用高劑量HHT(1.0mg/kg體重)可以完全根除小鼠體內(nèi)的AML-M5細(xì)胞，且到80天時(shí)所有小鼠仍處于無病生存。這些結(jié)果表明HHT結(jié)合于p-eIF4E，使其具有根除表達(dá)高水平p-eIF4E的AML的潛能。
　　6.p-eIF4E在部分AML患者中異常上調(diào)，而在正常個(gè)體中未見表達(dá)或低表達(dá)
　　已有文獻(xiàn)指出eIF4E在部

26、分白血病患者中是高表達(dá)的，但p-eIF4E在人急性髓系白血病患者中是否表達(dá)目前未見任何報(bào)道。因此，我們通過western blotting技術(shù)檢測了7例人AML細(xì)胞系，16例不同的AML原代樣本，20例健康成年捐贈的正常造血細(xì)胞樣品中的p-eIF4E和eIF4E蛋白水平。結(jié)果顯示7例AML細(xì)胞均表達(dá)高水平的p-eIF4E和eIF4E蛋白，16例原代樣本中有13例(81.25％)表達(dá)高水平的p-eIF4E和eIF4E蛋白，但在20例健康成

27、年中，8例表達(dá)低水平的p-eIF4E蛋白，12例不表達(dá)p-eIF4E蛋白。上述結(jié)果表明，相比于正常個(gè)體，p-eIF4E蛋白水平在部分AML患者中是高度上調(diào)的。
　　研究結(jié)論:
　　1.p-eIF4E是HHT抗急性髓系白血病作用的重要靶標(biāo)之一;
　　2.p-eIF4E絲氨酸209位磷酸化是HHT結(jié)合的關(guān)鍵位點(diǎn)之一;
　　3.HHT通過增強(qiáng)SUMO化途徑促進(jìn)p-eIF4E進(jìn)行蛋白酶體依賴的降解;
　　4.HHT