高三尖杉酯堿作用白血病細(xì)胞靶蛋白篩選及作用機(jī)制研究.pdf

1、背景:
　　白血病是起源于造血系統(tǒng)的常見(jiàn)惡性腫瘤，嚴(yán)重危害著人類健康。但是，其發(fā)病原因和疾病發(fā)展的確切病理機(jī)制迄今仍未闡明。目前，化學(xué)藥物聯(lián)合化療依然是臨床上大多數(shù)白血病患者最常用的治療方法。
　　高三尖杉酯堿是由中國(guó)科研人員于20世紀(jì)70年代首先從中草藥南方粗榧?jí)A中提取出來(lái)的抗白血病生物堿，在臨床上已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于急性髓系白血病的治療，并取得了良好的療效。此外，多項(xiàng)臨床試驗(yàn)表明，高三尖杉酯堿在伊馬替尼治療失敗的慢性髓系白血

2、病患者中仍然具有治療價(jià)值，尤其是在T315I突變的慢粒治療中起重要作用，提示該藥物可作為慢性髓系白血病患者的挽救治療選擇。目前藥物作用的分子機(jī)制尚不清楚，現(xiàn)有研究認(rèn)為，高三尖杉酯堿抗腫瘤活性主要與抑制蛋白合成和誘導(dǎo)凋亡兩大機(jī)制有關(guān)。但是，這些研究都不能回答該藥物直接作用的靶蛋白是什么。
　　因此，為了進(jìn)一步明確該藥的具體作用機(jī)制，我們?cè)诒狙芯恐兄苽淞烁呷馍减A親和柱，通過(guò)親和柱結(jié)合白血病細(xì)胞蛋白來(lái)尋找藥物直接結(jié)合的靶蛋白;并通過(guò)

3、建立靶蛋白高表達(dá)的細(xì)胞系，采用表達(dá)譜芯片技術(shù)、實(shí)時(shí)定量PCR以及免疫印跡等手段與方法來(lái)探討高三尖杉酯堿通過(guò)靶蛋白發(fā)揮抗白血病作用的可能分子機(jī)制。
　　方法:
　　1. 細(xì)胞培養(yǎng):
　　(1)人白血病細(xì)胞培養(yǎng):髓系白血病細(xì)胞系Kasumi-1、單核細(xì)胞白血病細(xì)胞系THP1和U937、慢性髓系白血病細(xì)胞系K562;
　　(2)逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞:經(jīng)改造后用于逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝的293細(xì)胞系Plat-GP細(xì)胞。
　　

4、2. 細(xì)胞增殖活力檢測(cè):MTS法
　　3. 細(xì)胞周期檢測(cè):流式細(xì)胞技術(shù)
　　4. 細(xì)胞凋亡檢測(cè):流式細(xì)胞技術(shù)，PI/Annexin-Ⅴ標(biāo)記物染色法檢測(cè)。
　　5. 親和柱制備:采用鏈親和素瓊脂糖親和樹(shù)脂以及生物素進(jìn)行制備，經(jīng)色譜-質(zhì)譜技術(shù)檢測(cè)。
　　6. 蛋白洗脫與鑒定:采用PBS、NaCl及高三尖杉酯堿溶液洗脫，純化干燥后獲得蛋白，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳后染色，切割并消化蛋白條帶后，通過(guò)蛋白質(zhì)譜技術(shù)對(duì)靶蛋白進(jìn)行分

5、析鑒定。
　　7. 構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株:采用逆轉(zhuǎn)錄病毒進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，通過(guò)嘌呤霉素篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)株，并經(jīng)過(guò)western blot驗(yàn)證。
　　8. 表達(dá)譜芯片分析:采用Affymetrix GeneChip(@) Human Genome U133 Plus2.0Array芯片檢測(cè)和分析穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系靶蛋白高表達(dá)后的基因表達(dá)譜的變化情況。
　　9. 實(shí)時(shí)定量PCR:檢測(cè)和驗(yàn)證芯片結(jié)果以及觀察經(jīng)高三尖杉酯堿處理后白血病細(xì)胞系的R

6、NA表達(dá)變化情況。
　　10. Western blot分析:檢測(cè)和驗(yàn)證芯片結(jié)果以及檢測(cè)經(jīng)高三尖杉酯堿作用后白血病細(xì)胞系的蛋白表達(dá)變化情況。
　　結(jié)果:
　　1. 高三尖杉酯堿對(duì)急性髓系白血病細(xì)胞系THP1、U937、和Kasumi-1細(xì)胞以及慢性髓系白血病細(xì)胞系K562有明顯的生長(zhǎng)抑制作用，作用48小時(shí)的IC50值分別為22.37 ng/ml、11.09 ng/ml、14.93 ng/ml和37.38 ng/ml。<

7、br>　　2. 高三尖杉酯堿能夠誘導(dǎo)人細(xì)胞白血病細(xì)胞系發(fā)生凋亡，藥物作用后凋亡細(xì)胞百分比明顯上升。
　　3. 高三尖酯堿親和柱結(jié)合的直接靶蛋白為actin-結(jié)合蛋白non muscle myosinheavy chainⅡA（NMHCⅡA），并且高三尖杉酯堿作用后可上調(diào)其在細(xì)胞中的表達(dá)水平。
　　4. 表達(dá)譜芯片結(jié)果提示，白血病細(xì)胞系穩(wěn)定高表達(dá)NMHCⅡA蛋白后，可引起基因表達(dá)譜發(fā)生改變，主要表現(xiàn)為細(xì)胞周期和MAPK激酶通路

8、相關(guān)基因表達(dá)水平的上調(diào)。
　　5. 實(shí)時(shí)定量PCR和Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果與表達(dá)譜芯片結(jié)果基本符合，主要表現(xiàn)為NMHCⅡA蛋白高表達(dá)后，細(xì)胞周期相關(guān)蛋白（主要為G1期→S期轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白）的上調(diào)，以及高三尖杉酯堿作用后細(xì)胞MAPK激酶通路上c-jun和JNK的激活和上調(diào)，可能由此促發(fā)凋亡程序的啟動(dòng)。
　　結(jié)論:
　　1. 高三尖杉酯堿能夠抑制白血病細(xì)胞系的生長(zhǎng)與增殖，并且促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的發(fā)生。
　　2.