高三尖杉酯堿誘導的白血病耐藥細胞基因表達譜的變化.pdf

1、白血?。↙eukemia）是臨床常見的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，化療仍是其治療的主要手段。高三尖杉酯堿（Homoharringtonine，HHT）系從粗榧屬植物中提取的一種生物堿，是高效抗白血病藥物，主要用于急性髓細胞白血病、慢性粒細胞白血病和骨髓增生異常綜合征的治療。近期研究表明，HHT還可用于干擾素治療失敗和伊馬替尼耐藥的慢性粒細胞白血病的治療。然而，臨床治療中發(fā)現(xiàn)，長時間應(yīng)用HHT治療后患者會出現(xiàn)多藥耐藥（multidrug resis

2、tance，MDR）現(xiàn)象，它與蒽環(huán)類、鬼臼類及長春新堿類等還有交叉耐藥性。白血病細胞產(chǎn)生MDR是導致白血病復發(fā)及化療失敗的主要原因，現(xiàn)今研究初步證實其多藥耐藥機制涉及P-gp等跨膜糖蛋白、GSH/GST等酶系統(tǒng)、DNA修復以及多種凋亡相關(guān)基因等，但仍不能圓滿解釋白血病細胞產(chǎn)生MDR的機制，而且在臨床上根據(jù)現(xiàn)有的多藥耐藥機制采取的逆轉(zhuǎn)耐藥措施并不十分有效。因此，尋找新的與HHT耐藥相關(guān)基因，揭示耐藥機制，進而發(fā)展新的逆轉(zhuǎn)耐藥方法十分必要。

3、主要研究內(nèi)容和主要結(jié)果如下： 第一部分：基因芯片篩選K562/HHT細胞多藥耐藥相關(guān)基因 基因芯片技術(shù)是一種快速高通量地分析細胞或生物體中核酸序列信息的研究方法。將該技術(shù)運用于腫瘤耐藥研究有助于篩選新的耐藥相關(guān)基因，對于腫瘤耐藥機制研究及耐藥個體化診斷具有重要促進作用。為此，本部分研究運用基因芯片技術(shù)來研究HHT誘導的白血病多藥耐藥細胞株K562/HHT基因表達譜的變化，初步篩選出與K562/HHT細胞多藥耐藥相關(guān)的基因

4、。 目的：用基因芯片技術(shù)篩選出與K562/HHT細胞多藥耐藥相關(guān)的基因。 方法：在前期建立的K562/HHT多藥耐藥細胞株的基礎(chǔ)上，采用基因芯片技術(shù)兩兩比較K562/HHT細胞與其親本細胞K562，K562/HHT細胞與用耐藥逆轉(zhuǎn)劑米非司酮（RU486）作用后的細胞K562/HHT/RU486間的基因表達譜差異。 結(jié)果： K562/HHT與K562細胞相比，共有117個基因表達有顯著差異，其中57個基因表達明顯上

5、調(diào)，60個基因表達明顯下調(diào)，K562/HHT中多藥耐藥基因mdr-1表達明顯上調(diào)（Ratio=4．2899）； K562/HHT/RU486細胞與K562/HHT細胞相比，有13個基因表達明顯上調(diào)，37個基因表達明顯下調(diào)。這些差異表達的基因涉及耐藥、細胞信號傳導、細胞分化、細胞增殖、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)基因以及離子轉(zhuǎn)運等?；騈M-001721（BMX）、NM-031459（SESN2）、NM-033642（FGF13）和AL-049309（SFR

6、S12）在兩組芯片中的表達均有顯著差異。其中BMX基因（bone marrow tyrosine kinase gene in chromosome X）在K562/HHT細胞中表達較K562細胞上調(diào)（Ratio=2．6036），在K562/HHT/RU486細胞則較K562/HHT細胞減低（Ratio=0．4603）。 結(jié)論：運用基因芯片技術(shù)獲得了與HHT誘導的多藥耐藥細胞K562/HHT耐藥相關(guān)候選基因的信息。 第二

7、部分：BMX參與HHT誘導的白血病多藥耐藥細胞株K562/HHT耐藥及機制的初步研究 BMX是從人骨髓細胞中克隆、分離到的一種基因，定位于染色體Xp22．2，其mRNA長度2．7kb，編碼一種80kD的蛋白，屬于細胞內(nèi)非受體型酪氨酸蛋白激酶Tec/Btk家族。BMX廣泛表達在動脈內(nèi)皮、胎兒心內(nèi)膜、粒細胞、骨髓細胞株以及前列腺細胞株等，參與胞內(nèi)外多種信號轉(zhuǎn)導，其功能非常廣泛，與細胞粘附、遷移、增殖和存活等相關(guān)。然而目前還沒有關(guān)于

8、BMX與白血病細胞耐藥性的相關(guān)研究。在前部分研究中我們用基因芯片技術(shù)篩選與K562/HHT細胞耐藥相關(guān)的候選基因，發(fā)現(xiàn)BMX可能與HHT誘導的白血病多藥耐藥細胞K562/HHT的耐藥性形成相關(guān)，該部分進一步驗證BMX基因在HHT誘導的白血病細胞耐藥形成中的作用，并探討其作用機制。 目的：探討B(tài)MX基因在HHT誘導的人白血病耐藥細胞K562/HHT耐藥性形成中的作用及其機制。 方法：運用RT-PCR和Western blo

9、t法驗證分別從mRNA和蛋白水平驗證BMX在K562和K562/HHT細胞中表達的基因芯片結(jié)果后，將BMX質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染到K562和K562/HHT細胞，然后運用MTT法和流式細胞術(shù)觀察這兩種細胞對幾種常用化療藥物的耐藥性的變化和細胞內(nèi)柔紅霉素（DNR）含量的變化。 結(jié)果： RT-PCR和Western blot法均證實BMX在K562/HHT細胞中表達較K562細胞上調(diào)，K562/HHT/RU486細胞中BMX表達較K562/H

10、HT減低。BMX質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功后，MTT法發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染BMX質(zhì)粒的K562細胞獲得耐藥性，而轉(zhuǎn)染BMX質(zhì)粒的K562/HHT細胞耐藥性增加。流式細胞術(shù)檢測到轉(zhuǎn)染BMX質(zhì)粒后的K562及K562/HHT細胞內(nèi)DNR含量分別為（79．28±4．04）和（29．84±2．67），均較轉(zhuǎn)染前（158．52±8．08）和（58．58±6．53）顯著減低。 結(jié)論：發(fā)現(xiàn)BMX與高三尖杉酯堿誘導的多藥耐藥細胞K562/HHT多藥耐藥性的形成相關(guān)，BM