靶向Plk1 PBD新型抗腫瘤藥物先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)與抗腫瘤機(jī)制研究.pdf

1、保羅樣激酶-1(Polo-likekinases1，Plk1)是廣泛存在于真核生物中的一類絲/蘇氨酸蛋白激酶。Plk1主要在細(xì)胞有絲分裂的G2晚期和M期表達(dá)，在有絲分裂啟動(dòng)、中心體成熟、紡錘體組裝、染色體分離及胞質(zhì)分裂等細(xì)胞有絲分裂過(guò)程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。Plk1在大部分惡性腫瘤細(xì)胞中呈過(guò)度表達(dá)并且與腫瘤的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)，被認(rèn)為是腫瘤治療最具潛力的重要靶點(diǎn)。與Plk1功能相反，Plk2和Plk3被認(rèn)為是重要的抑癌因子，在檢查點(diǎn)導(dǎo)致

2、的周期阻滯中發(fā)揮作用來(lái)保證基因組穩(wěn)定性，防止癌變。因此，小分子抑制劑對(duì)Plk1的高度選擇性是腫瘤靶向Plk1治療的關(guān)鍵問(wèn)題。
　　Plk1-3的結(jié)構(gòu)具有較大的相似性，N端具有一個(gè)高度同源的激酶結(jié)構(gòu)域(kinasedomain，KD)即ATP結(jié)合域(ATP binding pocket)，C端具有調(diào)節(jié)Plk1催化活性及亞細(xì)胞動(dòng)態(tài)定位的特征性結(jié)構(gòu)域PBD(Polo-Box domain，PBD)。由于ATP結(jié)合域在眾多激酶結(jié)構(gòu)中的高度

3、保守性及其結(jié)構(gòu)變異導(dǎo)致的耐藥問(wèn)題，這使開發(fā)高選擇性的Plk1抑制劑面臨極大的挑戰(zhàn)。故此，Plk1特有的底物結(jié)合域PBD成為新型Plk1小分子抑制劑開發(fā)的理想靶點(diǎn)。
　　目前，已經(jīng)報(bào)道的Plk1 PBD小分子抑制劑主要包括Poloxin及其結(jié)構(gòu)類似物百里醌(Thymoquinone，TQ)、Poloxipan、紅倍酚（Purpurogallin，PPG）和綠茶兒茶素類化合物(Green Tea Catechins)。但是，這些數(shù)量及

4、結(jié)構(gòu)有限的小分子抑制劑多屬天然產(chǎn)物，極大地限制了靶向Plk1 PBD小分子抑制劑的基于結(jié)構(gòu)的定向設(shè)計(jì)。靶向Plk1 PBD的小分子抑制劑的開發(fā)對(duì)于Plk1 PBD生物學(xué)功能的研究以及靶向Plk1PBD新型抗腫瘤藥物的定向設(shè)計(jì)具有重要的理論和實(shí)際意義。
　　在本研究中，我們利用所建立的熒光偏振高通量篩選模型對(duì)本室化合物庫(kù)（含20，000個(gè)小分子化合物）進(jìn)行高通量篩選，定向獲得靶向Plk1 PBD新型抗腫瘤藥物先導(dǎo)化合物—小分子抑制劑

5、T521。先導(dǎo)化合物T521為一類具有全新結(jié)構(gòu)的新型化合物，其為苯磺酰噁唑類化合物，本研究系本類化合物抗腫瘤活性的首次報(bào)道。小分子抑制劑T521對(duì)Plk1 PBD介導(dǎo)的GST-Map205PBM底物識(shí)別具有明顯的抑制作用，并且對(duì)Plk1 PBD具有較好的體外選擇性(Apparent IC50 PBD1≈1.22±0.13μM;Apparent IC50 PBD2,3＞500μM)。另外，我們發(fā)現(xiàn)小分子抑制劑T521對(duì)Plk1 PBD的抑

6、制作用具有明顯的時(shí)間依賴性和溫度依賴性，其與Plk1 PBD的結(jié)合為典型的“慢上慢下”的非共價(jià)鍵結(jié)合模式。上述這些性質(zhì)，與TQ和Poloxin與Plk1 PBD的結(jié)合模式極其相似。
　　在細(xì)胞毒性研究中發(fā)現(xiàn)，小分子抑制劑T521對(duì)12株腫瘤細(xì)胞具有明顯的細(xì)胞毒性，IC50值在1～5μM。但是，小分子抑制劑T521對(duì)MRC5、HEK-293和L02代表的正常細(xì)胞株的細(xì)胞毒性與腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性相比并沒(méi)有顯著差別，其IC50值在3～8

7、μM。上述數(shù)據(jù)表明，小分子抑制劑T521在體外對(duì)腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞具有等同的細(xì)胞毒性。上述這種現(xiàn)象在BI2536、Poloxin及PPG中也有類似的相關(guān)報(bào)道。以流式細(xì)胞儀和Western Blot進(jìn)行細(xì)胞周期阻滯分析中發(fā)現(xiàn)，小分子抑制劑T521可以明顯地使周期同步化的HeLa細(xì)胞發(fā)生劑量依賴性的G2/M期阻滯，延遲細(xì)胞周期進(jìn)程。另外，小分子抑制劑T521可以明顯地干擾Plk1亞細(xì)胞定位，引發(fā)前中期細(xì)胞阻滯、中心體片段化、染色體整列損傷及

8、紡錘體組裝障礙。在AnnexinⅤ/PI雙染實(shí)驗(yàn)及Western Blot實(shí)驗(yàn)進(jìn)行細(xì)胞凋亡分析中發(fā)現(xiàn)，小分子抑制劑T521可以明顯地引發(fā)HeLa細(xì)胞劑量依賴性的凋亡和PARP的大量斷裂。
　　綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)小分子抑制劑T521具有較好的抗腫瘤活性，其可以明顯地干擾Plk1亞細(xì)胞定位而抑制Plk1的生物學(xué)活性，引發(fā)前中期細(xì)胞阻滯、中心體片段化、染色體整列損傷及紡錘體組裝障礙，進(jìn)而使HeLa細(xì)胞發(fā)生G2/M期阻滯和大量凋亡。本研究