新型抗腫瘤化合物MONCPT的藥效學(xué)及機制研究.pdf

1、研究目的：評價新型抗腫瘤化合物MONCPT對TOPOI的抑制活性、對腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用，以及對PC-3和A549裸小鼠移植瘤模型的試驗治療作用，并探索MONCPT誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞周期阻滯及抑制腫瘤新生血管生成作用的分子機制。
　　 研究方法：
　　 1.MONCPT的體外抗腫瘤活性研究包括：(1)TOPOI活性抑制試驗檢測MOCPT對TOPOI活性的影響；(2)MTT法測定MONCPT對9種腫瘤細(xì)胞株體外抑制作用，計算其

2、半數(shù)抑制濃度((IC50)；(3)建立PC-3和A549裸小鼠移植瘤模型評價MONCPT的體內(nèi)抗腫瘤活性。
　　 2.MONCPT通過周期阻滯抑制腫瘤生長的機制研究包括：(1)流式細(xì)胞術(shù)檢測MONCPT作用PC3細(xì)胞和A549的細(xì)胞后周期的變化；(2)Western-blotting法檢測細(xì)胞內(nèi)周期相關(guān)蛋白的表達；(3)siRNA法沉默P53或P38基因的表達，MONCPT作用不同時間后流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期的變化；(4)siR

3、NA法沉默P53或P38基因的表達，MONCPT作用不同時間后檢測細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達。
　　 3.MONCPT抑制新生血管生成作用的研究：(1)MTT法測定MONCPT對內(nèi)皮細(xì)胞EA.hy926細(xì)胞的抑制作用，計算IC50值；(2)AO/EB染色法檢測MONCPT作用后EA.hy926內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡情況；(3)流式細(xì)胞術(shù)檢測MONCPT作用后EA.hy926內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡情況；(4)雞胚絨毛尿囊膜法檢測MONCPT對新生血管

4、生成的影響；(5)HUVEC遷移實驗檢測MONCPT對新生血管生成的影響；(6)HUVEC血管腔形成實驗檢測MONCPT對新生血管生成的影響。
　　 研究結(jié)果：
　　 1.MONCPT具有廣譜有效的體內(nèi)外抗腫瘤活性：(1)MONCPT可以顯著抑制TOPOI的活性，抑制DNA超螺旋的解旋；(2)MONCPT對9種腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出較強的體外抑制增殖作用，作用72h后計算半數(shù)抑制濃度IC50值為1.0×10-10 M-2.3×1

5、0-7M;(3)在A549裸小鼠移植瘤模型中，給藥15天后，MONCPT20mg/kg、MONCPT10mg/kg和MONCPT5mg/kg組腫瘤抑瘤率(％)分別為98.0、78.5和32.0，T/C(％)值分別為5.5、30.9和70。結(jié)果證實MONCPT在20mg/kg和10mg/kg劑量下都可以顯著抑制A549腫瘤的生長，具有很好的抗腫瘤活性。在PC-3裸小鼠移植瘤模型中給予MONCPT17天后，MONCPT20mg/kg、MON

6、CPT10mg/kg和MONCPT5mg/kg組T/C(％)值分別為16.7、37.7和71.3，抑瘤率(％)分別為77.7、51.8和29.6，結(jié)果證實，MONCPT在20mg/kg和10mg/kg劑量下都可以顯著抑制A549腫瘤的生長，具有很好的抗腫瘤活性。
　　 2.MONCPT通過調(diào)控周期相關(guān)蛋白的表達阻滯腫瘤細(xì)胞于G2-M期：(1)流式細(xì)胞術(shù)分析顯示MOCPT100nM可誘導(dǎo)A549細(xì)胞G2/M期阻滯，并具有時效依賴性

7、。MONCPT1000nM可誘導(dǎo)PC3細(xì)胞G0/G1期阻滯，而MONCPT10nM和100nM可誘導(dǎo)PC3細(xì)胞G2/M期阻滯；(2)MONCPT1000nM作用PC3細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，CDK2，CDK4和cyclin D1蛋白表達下調(diào)，而MONCPT10nM和100nM作用PC3細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，CDK7，CDK1和cyclin B1蛋白表達升高；(3)Westem-blot結(jié)果顯示，MONCPT可以通過上調(diào)p53蛋白，激活下游P21蛋白，從而下調(diào)

8、CDK1蛋白的表達，最終使A549細(xì)胞停滯在G2/M期；同時實驗結(jié)果表明MONCPT還可以通過下調(diào)CDK7、Cyclin H和Cdc25C蛋白表達，升高Weel蛋白表達以下調(diào)CDK1蛋白表達，最終導(dǎo)致A549細(xì)胞G2/M期阻滯。(4)MAPK和P13K/Akt信號通路在細(xì)胞周期調(diào)控中發(fā)揮重要的作用，結(jié)果表明MONCPT通過下調(diào)A549細(xì)胞中MAPK家族的p-ERK、JNK和p-AKT蛋白，上調(diào)p-P38和AKT蛋白參與G2/M期阻滯作用

9、的調(diào)控；
　　 3.MONCPT表現(xiàn)出很強的抑制新生血管生成的活性：(1)MONCPT對EA.hy926細(xì)胞作用72小時的IC50為0.13±0.04μM;(2)AO/EB染色發(fā)現(xiàn)，隨著MONCPT給藥濃度的升高，EA.hy926細(xì)胞的凋亡率隨之升高；(3)流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明，EA.hy926細(xì)胞的凋亡率與MONCPT存在濃度依賴性關(guān)系；(4)MONCPT對雞胚絨毛尿囊膜的新生血管形成具有明顯抑制作用；(5)MONCPT100n

10、M和200nM濃度可以顯著抑制HUVEC內(nèi)皮細(xì)胞的遷移；(6)MONCPT50nM、100nM和200nM給藥濃度可以明顯減少HUVEC細(xì)胞形成的完整血管腔數(shù)目，并且呈現(xiàn)一定的濃度依賴性。
　　 結(jié)論：
　　 (1)MONCPT具有廣譜的體外抗腫瘤活性及高效的體內(nèi)抗腫瘤生長活性；
　　 (2)MONCPT可能通過AKT、p53和MAPK通路阻滯腫瘤細(xì)胞于G2-M期；
　　 (3)MONCPT能顯著抑制新生