新靶向抗腫瘤候選化合物Z-GP-EPI的藥效學(xué)及心臟毒性考察.pdf

1、實(shí)驗(yàn)背景及目的：
　　表阿霉素（EPI）作為臨床上經(jīng)典的蒽環(huán)類廣譜抗腫瘤藥物，由于其較大的心臟毒性而影響了其在臨床一線中的廣泛應(yīng)用。近年來(lái)，用藥物化學(xué)手段改造藥物化學(xué)結(jié)構(gòu)而達(dá)到降低其毒性作用的方法較為常見。其中，研究得比較熱門，同時(shí)也比較成熟的有酶激活式靶向前藥設(shè)計(jì)策略等。
　　國(guó)內(nèi)外有大量的研究數(shù)據(jù)表明，腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞中有成纖維激活蛋白 alpha（FAPα）表達(dá)，而腫瘤的發(fā)生發(fā)展又與腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞有密切的關(guān)聯(lián)。以

2、FAPα為介導(dǎo)的酶激活式靶向抗腫瘤前藥設(shè)計(jì)策略正是利用腫瘤細(xì)胞內(nèi)外的FAPα作為切入點(diǎn)和突破口，將具有較大毒副作用的母藥改構(gòu)成幾乎無(wú)毒副作用且只能被FAPα特異性酶解的前藥。而前藥到達(dá)體內(nèi)正常組織，由于缺少必要的工具——FAPα酶，不能產(chǎn)生相應(yīng)的細(xì)胞毒性作用，從而達(dá)到預(yù)期降低藥物毒副作用的目的。前藥直接到達(dá)或經(jīng)體內(nèi)循環(huán)到達(dá)腫瘤組織，被特異性酶解釋放出母藥進(jìn)而通過(guò)母藥發(fā)揮抗腫瘤的療效。
　　在本課題組前期研究中，已將此 FAPα為切

3、入點(diǎn)的酶激活式靶向抗腫瘤前藥設(shè)計(jì)策略成功應(yīng)用于阿霉素（DOX），并經(jīng)系統(tǒng)成藥性研究驗(yàn)證可行。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，在臨床上 EPI的毒性特別是心臟毒性仍未得到解決且 EPI比 DOX更具有廣泛應(yīng)用的潛力，而EPI與DOX互為同分異構(gòu)體，僅一個(gè)手性碳原子的空間構(gòu)象互為順反異構(gòu)。因此，將此酶激活式靶向抗腫瘤藥物設(shè)計(jì)策略應(yīng)用于 EPI將會(huì)是一個(gè)很有意義的嘗試。前期研究中，已將母藥EPI改構(gòu)成前藥Z-GP-EPI，然而，能否實(shí)現(xiàn)靶向抗腫瘤的療效，降低心臟

4、毒性，尚需實(shí)驗(yàn)考察。
　　故本研究通過(guò)考察前藥Z-GP-EPI的靶向抗腫瘤療效和心臟毒性，首次對(duì)Z-GP-EPI的成藥性進(jìn)行初次評(píng)價(jià)。
　　實(shí)驗(yàn)方法：
　　1 Z-GP-EPI的靶向抗腫瘤療效
　　1.1體外抗腫瘤活性
　　選用非腫瘤細(xì)胞（HEK-293、NIH-3T3）、腫瘤細(xì)胞（4T1）和轉(zhuǎn)染后穩(wěn)定高表達(dá)FAPα的細(xì)胞（NIH-3T3/FAPα+、4T1/FAPα+），以母藥為對(duì)照，用MTT法考察Z-G

5、P-EPI在濃度為0.15–50μM的細(xì)胞毒性。
　　基于本課題組前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，驗(yàn)證同時(shí)檢測(cè) Z-GP-EPI和母藥 EPI的HPLC方法專屬性（流動(dòng)相：乙腈(A)-水(含0.1％TFA)(B)，梯度洗脫：0-1 min，A為30%；1-5 min，A為30%-70%；5-11 min，A為70%；流速：1 mL/min；UVD波長(zhǎng)：495 nm）。
　　基于本課題組前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，選用Z-GP-DOX對(duì)rhFAPα的酶解活性

6、進(jìn)行確證。進(jìn)而考察Z-GP-EPI能否被rhFAPα特異性酶解。將前藥Z-GP-EPI(15μg/mL)與rhFAPα(1μg/mL)37℃條件下共孵育，于0 h,2 h,4 h,8 h,12 h,24 h及36 h取上清液，HPLC法同時(shí)檢測(cè)Z-GP-EPI與EPI。
　　1.2體內(nèi)抗腫瘤療效
　　用乳腺癌4T1細(xì)胞構(gòu)建 Bal b/c荷瘤模型小鼠，將模型小鼠隨機(jī)分為 Z-GP-EPI高、低劑量組（3 mg/Kg和1.5

7、mg/Kg）和等摩爾劑量的EPI高、低劑量組（2 mg/Kg和1 mg/Kg）及Control組（10 mL/Kg）共5組，每組6只，經(jīng)尾靜脈注射隔天給藥，連續(xù)3周。隔天觀察、測(cè)量瘤體大小，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線，計(jì)算相對(duì)腫瘤增值率。第一次給藥22 d后頸椎脫位法處死小鼠，剝?nèi)×鰤K，稱重，計(jì)算抑瘤率。
　　2 Z-GP-EPI的心臟毒性
　　將Bal b/c小鼠隨機(jī)分為Z-GP-EPI高、低劑量組（15 mg/Kg和7.5 mg/

8、Kg），EPI組（5 mg/Kg）及Control組（20 mL/Kg）共4組，每組8只，經(jīng)腹腔注射隔天給藥，連續(xù)2周。隔天觀察小鼠生存狀態(tài)，記錄小鼠死亡數(shù)，計(jì)算生存率，測(cè)量體重，繪制體重變化曲線。第一次給藥14 d后股動(dòng)脈取血約1 mL，離心得血清做心肌酶檢測(cè)。頸椎脫位法處死后取心臟組織作常規(guī)HE檢查、Massion檢查和3-硝基酪氨酸蛋白免疫組化檢查。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　1 Z-GP-EPI的靶向抗腫瘤療效
　　1.1體外抗

9、腫瘤活性
　　根據(jù)48 h細(xì)胞存活率數(shù)據(jù)，Z-GP-EPI對(duì)非腫瘤細(xì)胞（HEK-293、NIH-3T3）的IC50＞50μM，而EPI對(duì)非腫瘤細(xì)胞（HEK-293、NIH-3T3）的IC50＜1μM；Z-GP-EPI對(duì)穩(wěn)定高表達(dá) FAPα的細(xì)胞（NIH-3T3/FAPα+、4T1/FAPα+）的IC50與母藥 EPI相近（約為0.2μM）。Z-GP-EPI特異性酶解結(jié)果顯示，2 h內(nèi)可檢測(cè)出游離EPI，在8 h約40%Z-GP-E

10、PI被酶解，在36 h約95%Z-GP-EPI前藥被酶解。
　　1.2體內(nèi)抗腫瘤療效
　　Z-GP-EPI高、低劑量組腫瘤的大小分別與Control組比較，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，相對(duì)腫瘤增值率均小于40%。且Z-GP-EPI低劑量組與等摩爾劑量的EPI組相比，具有相近的抑瘤率（約55%）。
　　2 Z-GP-EPI的心臟毒性
　　Z-GP-EPI高、低劑量組均未見小鼠死亡，體重?zé)o明顯降低。而EPI組在自第一次給藥后第

11、10 d出現(xiàn)死亡，至給藥結(jié)束，小鼠生存率為50%，且體重明顯減少。心肌酶譜檢測(cè)結(jié)果均顯示，Z-GP-EPI高、低劑量組與Control組無(wú)顯著性差異，而EPI組與Control組有顯著性差異。心臟 HE檢查、Massion檢查和3–硝基酪氨酸免疫組化檢查結(jié)果均顯示，Z-GP-EPI高、低劑量組未發(fā)現(xiàn)明顯病變，而EPI組發(fā)現(xiàn)心肌形態(tài)改變、溶解等明顯病變。結(jié)論：
　　1. Z-GP-EPI對(duì)正常細(xì)胞幾乎無(wú)毒性作用，能被FAPα特異性酶

12、解釋放出母藥EPI進(jìn)而通過(guò)EPI發(fā)揮細(xì)胞毒性作用，且在本研究使用的動(dòng)物模型中具有與母藥相近的抗腫瘤療效。
　　2. Z-GP-EPI相比于母藥EPI，明顯改善心臟毒性。
　　綜上可初步判斷，通過(guò) FAPα介導(dǎo)的酶激活式靶向抗腫瘤前藥設(shè)計(jì)策略修飾得到的前藥Z-GP-EPI保留了母藥的抗腫瘤療效，同時(shí)明顯改善了心臟毒性，已達(dá)到策略修飾的預(yù)期目的。因此，Z-GP-EPI也與 Z-GP-DOX一樣，有望成為新型 FAPα酶激活式靶向