新靶向抗腫瘤候選化合物Z-GP-EPI的藥效學及心臟毒性考察.pdf

1、實驗背景及目的：
　　表阿霉素（EPI）作為臨床上經典的蒽環(huán)類廣譜抗腫瘤藥物，由于其較大的心臟毒性而影響了其在臨床一線中的廣泛應用。近年來，用藥物化學手段改造藥物化學結構而達到降低其毒性作用的方法較為常見。其中，研究得比較熱門，同時也比較成熟的有酶激活式靶向前藥設計策略等。
　　國內外有大量的研究數(shù)據(jù)表明，腫瘤相關成纖維細胞中有成纖維激活蛋白 alpha（FAPα）表達，而腫瘤的發(fā)生發(fā)展又與腫瘤相關成纖維細胞有密切的關聯(lián)。以

2、FAPα為介導的酶激活式靶向抗腫瘤前藥設計策略正是利用腫瘤細胞內外的FAPα作為切入點和突破口，將具有較大毒副作用的母藥改構成幾乎無毒副作用且只能被FAPα特異性酶解的前藥。而前藥到達體內正常組織，由于缺少必要的工具——FAPα酶，不能產生相應的細胞毒性作用，從而達到預期降低藥物毒副作用的目的。前藥直接到達或經體內循環(huán)到達腫瘤組織，被特異性酶解釋放出母藥進而通過母藥發(fā)揮抗腫瘤的療效。
　　在本課題組前期研究中，已將此 FAPα為切

3、入點的酶激活式靶向抗腫瘤前藥設計策略成功應用于阿霉素（DOX），并經系統(tǒng)成藥性研究驗證可行。近年來發(fā)現(xiàn)，在臨床上 EPI的毒性特別是心臟毒性仍未得到解決且 EPI比 DOX更具有廣泛應用的潛力，而EPI與DOX互為同分異構體，僅一個手性碳原子的空間構象互為順反異構。因此，將此酶激活式靶向抗腫瘤藥物設計策略應用于 EPI將會是一個很有意義的嘗試。前期研究中，已將母藥EPI改構成前藥Z-GP-EPI，然而，能否實現(xiàn)靶向抗腫瘤的療效，降低心臟

4、毒性，尚需實驗考察。
　　故本研究通過考察前藥Z-GP-EPI的靶向抗腫瘤療效和心臟毒性，首次對Z-GP-EPI的成藥性進行初次評價。
　　實驗方法：
　　1 Z-GP-EPI的靶向抗腫瘤療效
　　1.1體外抗腫瘤活性
　　選用非腫瘤細胞（HEK-293、NIH-3T3）、腫瘤細胞（4T1）和轉染后穩(wěn)定高表達FAPα的細胞（NIH-3T3/FAPα+、4T1/FAPα+），以母藥為對照，用MTT法考察Z-G

5、P-EPI在濃度為0.15–50μM的細胞毒性。
　　基于本課題組前期實驗基礎，驗證同時檢測 Z-GP-EPI和母藥 EPI的HPLC方法專屬性（流動相：乙腈(A)-水(含0.1％TFA)(B)，梯度洗脫：0-1 min，A為30%；1-5 min，A為30%-70%；5-11 min，A為70%；流速：1 mL/min；UVD波長：495 nm）。
　　基于本課題組前期實驗基礎，選用Z-GP-DOX對rhFAPα的酶解活性

6、進行確證。進而考察Z-GP-EPI能否被rhFAPα特異性酶解。將前藥Z-GP-EPI(15μg/mL)與rhFAPα(1μg/mL)37℃條件下共孵育，于0 h,2 h,4 h,8 h,12 h,24 h及36 h取上清液，HPLC法同時檢測Z-GP-EPI與EPI。
　　1.2體內抗腫瘤療效
　　用乳腺癌4T1細胞構建 Bal b/c荷瘤模型小鼠，將模型小鼠隨機分為 Z-GP-EPI高、低劑量組（3 mg/Kg和1.5

7、mg/Kg）和等摩爾劑量的EPI高、低劑量組（2 mg/Kg和1 mg/Kg）及Control組（10 mL/Kg）共5組，每組6只，經尾靜脈注射隔天給藥，連續(xù)3周。隔天觀察、測量瘤體大小，繪制腫瘤生長曲線，計算相對腫瘤增值率。第一次給藥22 d后頸椎脫位法處死小鼠，剝取瘤塊，稱重，計算抑瘤率。
　　2 Z-GP-EPI的心臟毒性
　　將Bal b/c小鼠隨機分為Z-GP-EPI高、低劑量組（15 mg/Kg和7.5 mg/

8、Kg），EPI組（5 mg/Kg）及Control組（20 mL/Kg）共4組，每組8只，經腹腔注射隔天給藥，連續(xù)2周。隔天觀察小鼠生存狀態(tài)，記錄小鼠死亡數(shù)，計算生存率，測量體重，繪制體重變化曲線。第一次給藥14 d后股動脈取血約1 mL，離心得血清做心肌酶檢測。頸椎脫位法處死后取心臟組織作常規(guī)HE檢查、Massion檢查和3-硝基酪氨酸蛋白免疫組化檢查。實驗結果：
　　1 Z-GP-EPI的靶向抗腫瘤療效
　　1.1體外抗

9、腫瘤活性
　　根據(jù)48 h細胞存活率數(shù)據(jù)，Z-GP-EPI對非腫瘤細胞（HEK-293、NIH-3T3）的IC50＞50μM，而EPI對非腫瘤細胞（HEK-293、NIH-3T3）的IC50＜1μM；Z-GP-EPI對穩(wěn)定高表達 FAPα的細胞（NIH-3T3/FAPα+、4T1/FAPα+）的IC50與母藥 EPI相近（約為0.2μM）。Z-GP-EPI特異性酶解結果顯示，2 h內可檢測出游離EPI，在8 h約40%Z-GP-E

10、PI被酶解，在36 h約95%Z-GP-EPI前藥被酶解。
　　1.2體內抗腫瘤療效
　　Z-GP-EPI高、低劑量組腫瘤的大小分別與Control組比較，均具有統(tǒng)計學意義，相對腫瘤增值率均小于40%。且Z-GP-EPI低劑量組與等摩爾劑量的EPI組相比，具有相近的抑瘤率（約55%）。
　　2 Z-GP-EPI的心臟毒性
　　Z-GP-EPI高、低劑量組均未見小鼠死亡，體重無明顯降低。而EPI組在自第一次給藥后第

11、10 d出現(xiàn)死亡，至給藥結束，小鼠生存率為50%，且體重明顯減少。心肌酶譜檢測結果均顯示，Z-GP-EPI高、低劑量組與Control組無顯著性差異，而EPI組與Control組有顯著性差異。心臟 HE檢查、Massion檢查和3–硝基酪氨酸免疫組化檢查結果均顯示，Z-GP-EPI高、低劑量組未發(fā)現(xiàn)明顯病變，而EPI組發(fā)現(xiàn)心肌形態(tài)改變、溶解等明顯病變。結論：
　　1. Z-GP-EPI對正常細胞幾乎無毒性作用，能被FAPα特異性酶

12、解釋放出母藥EPI進而通過EPI發(fā)揮細胞毒性作用，且在本研究使用的動物模型中具有與母藥相近的抗腫瘤療效。
　　2. Z-GP-EPI相比于母藥EPI，明顯改善心臟毒性。
　　綜上可初步判斷，通過 FAPα介導的酶激活式靶向抗腫瘤前藥設計策略修飾得到的前藥Z-GP-EPI保留了母藥的抗腫瘤療效，同時明顯改善了心臟毒性，已達到策略修飾的預期目的。因此，Z-GP-EPI也與 Z-GP-DOX一樣，有望成為新型 FAPα酶激活式靶向