白藜蘆醇引起HL60細胞糖代謝改變及其分子機制研究.pdf

1、背景及目的:
　　背景：白藜蘆醇(resveratrol，RSV)化學名為反式-3,4’,5-三羥基-1,2-二苯乙烯(C14H12O3)，屬于在多種植物中都發(fā)現(xiàn)了的多酚類，白藜蘆醇天然含量最豐富的是首烏，一種用作中藥的植物根部。白藜蘆醇也大量存在于花生、虎杖、葡萄和紅酒。文獻中描述白藜蘆醇的多種功效涉及到心臟保護，抗癌，抗炎和抗氧化功能。同時有文獻報道白藜蘆醇可以作為熱量限制器發(fā)揮可能的抗衰老和抗糖尿病功效。Jang等人研究發(fā)現(xiàn)

2、白藜蘆醇可以從啟動、促進和進展各個階段抑制腫瘤。他們發(fā)現(xiàn)在在個體實驗中近白藜蘆醇處理后每只小鼠高達98％的腫瘤抑制率。白藜蘆醇可通過各種互補的方式抑制腫瘤，它可以抑制各種環(huán)氧加酶的活性，這可以降低癌癥的風險。另外一個白藜蘆醇阻止腫瘤形成的機制是引起細胞周期阻止和凋亡。另外，體內實驗明顯表明這種小分子治療癌癥的希望，但是關于紅酒飲用與癌癥之間的關系的研究仍處于研究階段。目前已有文獻報道白藜蘆醇能夠誘導人早幼粒白血病HL-60細胞的凋亡，能

3、夠將細胞周期阻滯在G1期，提高BAX/Bcl-2的比值，但其機制仍不清楚。本實驗以HL-60細胞為材料，從細胞代謝角度去研究白藜蘆醇引起HL60細胞死亡的分子機制。
　　目的：研究RSV誘導HL-60細胞死亡過程中，糖代謝的變化及Ca2+、活性氧組份ROS在其中的作用和機制。
　　材料和方法:
　　用含10%超級新生牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基體外培養(yǎng)HL60細胞，用25μM,50μM,100μM的RSV分別處理處于

4、對數(shù)期的HL60細胞24 h、48h，倒置相差顯微鏡觀察HL60細胞的形態(tài)學變化；MTT方法檢測細胞的存活率；全波長熒光酶標儀檢測不同濃度RSV、不同時間作用后相關的熒光值變化【鈣離子濃度、過氧化氫(H2O2)、超氧陰離子(O2-)、線粒體膜電位(MMP)變化】；Western blot檢測相關通路蛋白的表達變化以及糖代謝相關蛋白的表達變化；G6PD酶活性試劑盒檢測G6PD酶活性的變化；PCR以及定量實時熒光PCR檢測
　　G6P

5、D mRNA的變化。
　　結果:
　　1. MTT法檢測，不同劑量的RSV對HL60細胞有不同程度的殺傷作用，這種作用呈劑量依賴性關系。
　　2.全波長熒光酶標儀的結果顯示25μM,50μM,100μM的RSV處理HL-60細胞24 h后，O2-的量逐漸增加，而MMP與H2O2的量則迅速下降，作用48h后，趨勢更為明顯；加入鈣離子螯合劑EGTA后，O2-的增加趨勢下降，MMP與H2O2的上升趨勢上升。
　　3.全

6、波長熒光酶標儀的結果顯示25μM,50μM,100μM的RSV處理HL-60細胞24 h后，鈣離子含量逐漸增加，作用48h后，趨勢更為明顯。
　　4. Western Blotting檢測相關通路的蛋白表達，隨著白藜蘆醇作用濃度增加，P-AMPK, P-Akt表達量下降，P-Erk表達量上升；隨著作用時間延長而增長，P-AMPK, P-Akt表達量下降，P-Erk表達量下降。
　　5. Western Blotting檢測糖

7、酵解通路的蛋白表達，隨著白藜蘆醇作用濃度增加和作用時間延長而增長，蛋白表達量下降。
　　6. Western Blotting以及PCR技術分析顯示G6PD表達量上升。
　　7. G6PD酶活性檢測顯示G6PD酶活性上升。
　　結論:
　　1．RSV能在一定濃度范圍內在體外抑制HL-60細胞生長和增值，并且這種作用呈時間和劑量依賴關系。
　　2．鈣離子和ROS在RSV引起HL60細胞凋亡過程中起信號分子的作