CDK2的泛素化降解誘導(dǎo)急性髓性白血病細(xì)胞分化的作用及機(jī)制研究.pdf

1、針對(duì)急性髓性白血病（Acute myeloid leukemia，AML）分化障礙的特征，全反式維甲酸（All-trans retinoic acid，ATRA）被用于誘導(dǎo)分化治療急性早幼粒細(xì)胞白血病（Acute promyelocytic leukemia，APL）獲得巨大成功。但是至今為止，腫瘤分化治療仍存在局限性，包括臨床可用藥物少和臨床適用范圍窄等。因此，尋找腫瘤細(xì)胞分化調(diào)控的新分子靶點(diǎn)與信號(hào)通路，并基于該靶點(diǎn)和信號(hào)通路研究分化

2、治療的新方法和新手段，是現(xiàn)階段分化治療藥物研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)問題。前期研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周期依賴性激酶2（Cyclin dependent kinase2，CDK2）在急性髓性白血病細(xì)胞被誘導(dǎo)分化過程中發(fā)生明顯下降，且泛素蛋白酶體抑制劑MG132可以逆轉(zhuǎn)CDK2的下降過程。雖然CDK2蛋白的功能研究一直集中在細(xì)胞周期調(diào)控方面，但是多項(xiàng)研究結(jié)果提示CDK2可能不是細(xì)胞生長所必須的分子，并且越來越多的研究表明CDK2表達(dá)或活性下降對(duì)于細(xì)胞自我更新和

3、分化具有重要意義。以上提示我們，CDK2蛋白可能可以作為一個(gè)分化抑制因子被泛素蛋白酶體所降解，進(jìn)而參與調(diào)控AML細(xì)胞分化進(jìn)程。因此，我們希望研究CDK2蛋白在AML細(xì)胞分化中的蛋白下降模式及其分子調(diào)控機(jī)制，并且探索CDK2蛋白是否在急性髓性白血病細(xì)胞分化中扮演分化抑制因子的角色，對(duì)于尋找新的腫瘤分化治療策略具有積極意義。本研究分為三個(gè)部分：
　　第一部分：
　　目的：急性髓性白血病細(xì)胞分化過程中CDK2蛋白的泛素化降解及其分

4、子機(jī)制。
　　方法：采用流式細(xì)胞術(shù)結(jié)合CD11b考察AML細(xì)胞株（HL60、U937和NB4）在不同分化誘導(dǎo)劑作用后的分化情況;采用Western blot檢測(cè)AML細(xì)胞株被誘導(dǎo)分化過程中的CDK2蛋白水平變化;采用人淋巴細(xì)胞分離液從AML病人骨髓血液樣本中分離人原代AML樣本（Leu-1、Leu-2和Leu-3）;采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR考察不同分化誘導(dǎo)劑作用AML細(xì)胞株后CDK2基因水平變化;采用蛋白酶體抑制劑和自噬溶酶體抑制劑

5、分別與分化誘導(dǎo)劑聯(lián)合使用確定CDK2蛋白的降解模式;采用免疫沉淀技術(shù)考察CDK2蛋白的泛素化修飾水平;采用賴氨酸突變?yōu)榫彼岬姆绞綄ふ褻DK2蛋白的優(yōu)先泛素化位點(diǎn);采用酵母雙雜交技術(shù)尋找CDK2蛋白的特異性泛素化E3酶;采用免疫沉淀技術(shù)確證CDK2蛋白和E3酶的相互結(jié)合;采用shRNA干擾技術(shù)沉默E3酶，檢測(cè)CDK2蛋白的降解半衰期。
　　結(jié)果：⑴急性髓性白血病細(xì)胞分化過程中CDK2發(fā)生泛素化降解：CDK2在急性髓性白血病分化過程

6、中蛋白水平發(fā)生特異性下降:四種分化誘導(dǎo)劑(ATRA、TPA、DMSO和Dasa)在誘導(dǎo)AML細(xì)胞株發(fā)生分化時(shí)，CDK2蛋白發(fā)生顯著下降;ATRA誘導(dǎo)原代AML樣本發(fā)生分化時(shí)，CDK2蛋白發(fā)生明顯下降;ATRA在誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞株U2OS細(xì)胞發(fā)生分化時(shí)，CDK2蛋白水平保持相對(duì)穩(wěn)定；CDK2在急性髓性白血病細(xì)胞分化過程中的下降與基因水平調(diào)控?zé)o關(guān):實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，四種分化誘導(dǎo)劑對(duì)AML細(xì)胞株的CDK2 mRNA水平?jīng)]有顯著影響；C

7、DK2在急性髓性白血病細(xì)胞分化過程中的下降依賴于泛素蛋白酶體通路降解:AML細(xì)胞株在ATRA作用后所發(fā)生的CDK2蛋白下降可以被蛋白酶體抑制劑MG132所逆轉(zhuǎn)，但不能被自噬抑制劑3-MA和CQ所逆轉(zhuǎn);TPA作用AML細(xì)胞株所引起的CDK2的下降同樣可以被MG132抑制。⑵急性髓性白血病細(xì)胞分化過程中CDK2泛素化降解的的分子機(jī)制：CDK2可發(fā)生多聚泛素化修飾:在COS7細(xì)胞中共表達(dá)CDK2-HA和His-Ub，免疫沉淀結(jié)果顯示CDK2可

8、以發(fā)生多聚泛素化修飾，且MG132可以進(jìn)一步累積這種修飾;當(dāng)Ub的48位賴氨酸被突變?yōu)榫彼岷?，CDK2的多聚泛素化修飾受到明顯抑制；CDK2泛素化降解的優(yōu)先泛素化修飾位點(diǎn)是129位和142位賴氨酸:當(dāng)CDK2的129位和142位賴氨酸突變?yōu)榫彼岷?，蛋白合成抑制劑CHX介導(dǎo)的CDK2蛋白水平下調(diào)被部分逆轉(zhuǎn)，而當(dāng)兩者同時(shí)突變時(shí)則可以完全抑制CDK2蛋白下降;在9個(gè)潛在泛素化位點(diǎn)被全突變的基礎(chǔ)上，只有129位或142位重新突變?yōu)橘嚢彼岷螅?/p>

9、CDK2重新發(fā)生泛素化降解；介導(dǎo)CDK2泛素化修飾的泛素E3連接酶是KLHL6蛋白:酵母雙雜交技術(shù)聯(lián)合E3s庫發(fā)現(xiàn)共有10個(gè)潛在的泛素化E3酶和CDK2結(jié)合，其中KLHL6可以明顯促進(jìn)CDK2泛素化修飾水平;過表達(dá)KLHL6可以加快CDK2蛋白的降解速度，而沉默KLHL6則可以減慢CHX引起的CDK2蛋白水平下降速度。
　　第二部分：
　　目的：CDK2的泛素化降解對(duì)急性髓性白血病細(xì)胞分化的作用研究。
　　方法：采用s

10、hRNA干擾聯(lián)合慢病毒感染沉默AML細(xì)胞株中的CDK2蛋白;采用細(xì)胞計(jì)數(shù)和臺(tái)盼藍(lán)拒染法考察CDK2沉默后對(duì)AML細(xì)胞的增殖和存活的影響;采用細(xì)胞表面抗原CD11b表達(dá)水平、對(duì)NBT的還原能力和細(xì)胞核形態(tài)變化檢測(cè)CDK2沉默后對(duì)AML細(xì)胞分化的作用;采用同義突變進(jìn)行CDK2蛋白在shRNA基礎(chǔ)上重新過表達(dá);采用CDK2小分子抑制劑抑制CDK2的激酶活性，并考察其對(duì)AML細(xì)胞的誘導(dǎo)分化作用;采用PI單染結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)考察CDK2抑制劑對(duì)AM

11、L細(xì)胞的死亡誘導(dǎo)情況;采用裸小鼠腋下接種AML細(xì)胞，并瘤內(nèi)注射shCDK2慢病毒，通過檢測(cè)腫瘤體積和瘤內(nèi)細(xì)胞的CD11b表達(dá)水平檢測(cè)CDK2對(duì)AML腫瘤生長影響;采用NOD-SCID小鼠尾靜脈注射shCDK2慢病毒感染的AML細(xì)胞，流式檢測(cè)hCD45/mCD45水平或者血涂片染色考察NOD-SCID AML小鼠的外周血液中的AML細(xì)胞的浸潤情況，并定期檢測(cè)CDK2對(duì)AML小鼠的生存時(shí)間的影響。
　　結(jié)果：⑴CDK2蛋白水平下降對(duì)急

12、性髓性白血病細(xì)胞分化的作用研究：沉默CDK2對(duì)急性髓性白血病細(xì)胞增殖的影響:采用shRNA聯(lián)合慢病毒感染沉默AML細(xì)胞株中的CDK2蛋白，shCDK2＃2效果最好，shCDK2＃3次之，shCDK2＃1相對(duì)較弱;三個(gè)shCDK2均可以明顯抑制AML細(xì)胞的增殖，且shCDK2＃2效果最強(qiáng)，shCDK2＃3次之，shCDK2＃1相對(duì)較弱；沉默CDK2對(duì)急性髓性白血病細(xì)胞分化的影響:三個(gè)shCDK2均可以明顯上調(diào)CD11b的表達(dá)（從對(duì)照組的5

13、.39±1.59％分別上升到33.7±0.18％、55.0±6.09％和40.7±2.54％）;三個(gè)shCDK2均可以增強(qiáng)細(xì)胞NBT還原能力;shCDK2組的AML細(xì)胞核多呈現(xiàn)半月形，同時(shí)核質(zhì)比明顯減少;shCDK1和shCDK2均可以明顯抑制AML細(xì)胞的增殖，但只有shCDK2可以明顯促進(jìn)AML細(xì)胞分化；沉默CDK2對(duì)急性髓性白血病病人臨床樣本的誘導(dǎo)分化作用:shCDK2＃2感染的原代樣本的CD11b表達(dá)水平明顯上調(diào)，細(xì)胞核形態(tài)發(fā)生明

14、顯變化以及細(xì)胞分化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子STAT1、PU.1和CEBPβ均發(fā)生明顯上調(diào)。⑵CDK2的激酶活性抑制對(duì)急性髓性白血病細(xì)胞分化的影響：CDK2顯性失活突變體D145N參與調(diào)控AML細(xì)胞分化進(jìn)程:細(xì)胞分化表面標(biāo)志物CD11b和瑞氏吉姆薩染色結(jié)果均顯示，在shCDK2＃2促進(jìn)AML細(xì)胞株發(fā)生分化的基礎(chǔ)上，重新過表達(dá)HA-CDK2(CM14)可以抑制這一效應(yīng)，而HA-D145N(CM14)則沒有類似的逆轉(zhuǎn)shCDK2介導(dǎo)的分化效果；CDK2小

15、分子抑制劑誘導(dǎo)AML細(xì)胞發(fā)生分化:三個(gè)CDK2抑制劑（SU9516、CVT313和Nu6102）在不會(huì)導(dǎo)致AML細(xì)胞株發(fā)生明顯的死亡的基礎(chǔ)上，可以促使AML細(xì)胞的CD11b表達(dá)升高，NBT還原能力顯著增強(qiáng)。⑶抑制CDK2誘導(dǎo)急性髓性白血病細(xì)胞分化的體內(nèi)抗腫瘤活性研究：CDK2下降通過誘導(dǎo)AML細(xì)胞分化抑制裸鼠腋下移植瘤生長:Scramble組的瘤體積不斷增長，而shCDK2組腫瘤增長明顯受到抑制（在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，對(duì)照組瘤體積為2539±3

16、86mm3，shCDK2組為969±188mm3）;shCDK2組的瘤內(nèi)細(xì)胞CDK2水平相較于Scramble組發(fā)生明顯下降;與Scramble組相比，shCDK2組的CD11b表達(dá)水平顯著增加；CDK2下降通過誘導(dǎo)AML細(xì)胞分化延長NOD-SCID白血病小鼠生存時(shí)間:Scramble組的小鼠血液中hCD45+mCD45的比例隨著時(shí)間的延長明顯增加（在第32天、第38天和第40天分別為2.04±0.92％、6.91±3.47％和24.8

17、5±8.03％），而shCDK2組血液中的hCD45+mCD45-的比例一直保持在較低狀態(tài)（在第32天、第38天和第40天分別為1.08±0.53％、1.71±1.33％和1.34±1.16％）;血涂片結(jié)果同樣顯示Scramble組的小鼠血液中存在較高比例的人源性HL60細(xì)胞，而shCDK2組則檢測(cè)不到;Scramble組的5只小鼠分別在第41、43、43、44和44天死亡，而相對(duì)應(yīng)的shCDK2組的小鼠沒有發(fā)生明顯的死亡情況。

18、　　第三部分：
　　目的：CDK2的泛素化降解調(diào)控急性髓性白血病細(xì)胞分化的分子機(jī)制探索。
　　方法：采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)考察CDK2沉默后分化相關(guān)因子的mRNA水平;采用基因芯片考察抑制CDK2誘導(dǎo)分化過程中AML細(xì)胞的基因表達(dá)情況;采用Cluster程序?qū)Σ町愋曰蜻M(jìn)行分層聚類分析;采用shRNA聯(lián)合慢病毒感染技術(shù)沉默AML細(xì)胞中MAFB的表達(dá);采用冰凍切片聯(lián)合免疫熒光技術(shù)考察裸鼠腋下腫瘤中MAFB和CDK2的蛋白水

19、平;采用Western blot技術(shù)檢測(cè)CDK2沉默誘導(dǎo)AML細(xì)胞分化過程中PML/RARα的降解情況;采用RARE熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)shCDK2對(duì)RARα轉(zhuǎn)錄活性的影響;采用免疫沉淀富集CDK2蛋白并聯(lián)合LC/MS/MS技術(shù)尋找與CDK2相互作用的蛋白;采用DCFDA探針檢測(cè)shCDK2誘導(dǎo)AML細(xì)胞分化過程中細(xì)胞內(nèi)H2O2的水平變化;采用免疫沉淀技術(shù)確證CDK2蛋白與過氧化物酶家族PRDXs蛋白的結(jié)合情況;采用Western

20、blot技術(shù)檢測(cè)下調(diào)CDK2介導(dǎo)的AML細(xì)胞分化過程中PRDXs的蛋白水平;采用大腸桿菌原核系統(tǒng)體外純化CDK2和PRDX2重組蛋白;采用經(jīng)典的TRX/TRXR/NADPH偶聯(lián)PRDX酶活體系檢測(cè)體外PRDX的過氧化物酶活性;采用shRNA技術(shù)聯(lián)合慢病毒感染沉默AML細(xì)胞中的PRDX2水平，并結(jié)合CDl1b表達(dá)、NBT還原能力和核形態(tài)檢測(cè)AML細(xì)胞的分化水平。
　　結(jié)果：⑴CDK2泛素化降解調(diào)控分化的下游網(wǎng)絡(luò)及其關(guān)鍵因子尋找:①沉

21、默CDK2誘導(dǎo)急性髓性白血病細(xì)胞分化過程的基因表達(dá)譜分析:采用人基因表達(dá)譜芯片Affymetrix U133 Plus2.0分析發(fā)現(xiàn)，在第2天和第5天中分別有35（其中18個(gè)上調(diào)，17個(gè)下調(diào)）和499（其中473個(gè)上調(diào)，26個(gè)下調(diào)）個(gè)基因呈現(xiàn)出顯著性變化，而其中有16個(gè)基因在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的三個(gè)shCDK2組中都發(fā)生明顯上調(diào);②MAFB在CDK2調(diào)控急性髓性白血病細(xì)胞分化過程中的關(guān)鍵作用:在這16個(gè)基因中，MAFB的上調(diào)倍數(shù)最為明顯（在三組

22、shCDK2中分別上調(diào)151、64和252倍）;在CDK2沉默的AML細(xì)胞株中，MAFB的蛋白表達(dá)發(fā)生上調(diào);在腋下瘤組織中，shCDK2組的MAFB的蛋白表達(dá)也呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì);shMAFB＃1和shMAFB＃2均可以明顯的抑制第2天和第5天時(shí)shCDK2介導(dǎo)的CD11b上調(diào)和NBT還原能力的增加。⑵CDK2調(diào)控急性髓性白血病細(xì)胞分化的直接作用靶點(diǎn)及分子機(jī)制尋找：CDK2下降誘導(dǎo)分化過程中對(duì)PML/RARα及RARα的影響:shCDK2不能

23、降解PML/RARα，且對(duì)RARα蛋白水平?jīng)]有影響;RARE熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)結(jié)果表明，shCDK2不能促進(jìn)RARα轉(zhuǎn)錄活性的增加；H2O2在CDK2抑制誘導(dǎo)AML細(xì)胞分化過程中發(fā)揮重要作用:相較于Scramble組，shCDK2＃2組的AML細(xì)胞呈現(xiàn)明顯的H2O2累積現(xiàn)象;H2O2清除劑NAC可以明顯的抑制shCDK2介導(dǎo)的CD11b表達(dá)水平的上調(diào)和NBT還原能力的增加；CDK2通過直接作用PRDX2調(diào)控急性髓性白血病細(xì)胞分化過程:

24、LC/MS/MS檢測(cè)結(jié)果顯示，共有68個(gè)蛋白被富集到CDK2蛋白上，其中包括了兩個(gè)PRDXs家族成員（PRDX1和PRDX2）；在AML細(xì)胞株中PRDX1和PRDX2均表達(dá)，但是只有PRDX2和CDK2相互作用;shCDK2不影響AML細(xì)胞中PRDX2的蛋白表達(dá)水平;體外酶活實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CDK2可以顯著促進(jìn)PRDX2對(duì)NADPH的消耗能力;shPRDX2可以介導(dǎo)AML細(xì)胞的CD11b表達(dá)水平發(fā)生上調(diào)、NBT還原能力顯著增加，以及核形態(tài)

25、呈現(xiàn)半月形或馬蹄形等粒性成熟特征。
　　結(jié)論：研究發(fā)現(xiàn)在急性髓性白血病細(xì)胞被誘導(dǎo)分化過程中CDK2蛋白發(fā)生了KLHL6介導(dǎo)的特異性泛素蛋白酶體降解;而進(jìn)一步研究則顯示基因沉默或采用小分子化合物抑制CDK2均可以誘導(dǎo)急性髓性白血病細(xì)胞退出分化阻滯，進(jìn)而抑制腫瘤體積的增長，延長AML白血病小鼠的生存時(shí)間;基因表達(dá)譜分析和質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果揭示CDK2可能是通過靶向PRDX2促進(jìn)其過氧化物酶的活性，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)H2O2的下降，抑制下游分化通