Mdm2抑制物治療乳腺癌及成人急性髓細胞性白血病的作用機制的研究.pdf

1、TP53(編碼p53蛋白)是研究得最多的抑癌基因,具有維護基因組穩(wěn)定性及嚴密調控細胞生長的功能。p53蛋白作為轉錄因子通過與特定的DNA序列結合,轉錄激活下游基因。Mdm2基因是受p53蛋白轉錄調控的下游基因之一,p53激活Mdm2,后者編碼的蛋白通過與p53蛋白的特異性結合,抑制p53的功能。Mdm2蛋白通過其泛素蛋白連接酶的作用,使p53蛋白發(fā)生泛素化,并促進其被蛋白酶體降解。Mdm2蛋白正是通過這樣一個“自調節(jié)負反饋環(huán)”對細胞內p

2、53蛋白的合理水平進行精細的調控。p53激活的經(jīng)典模型如下:攜帶野生型p53(wt-p53)蛋白的腫瘤細胞遭受DNA損傷后,p53蛋白發(fā)生磷酸化,其蛋白質結構發(fā)生改變,與Mdm2蛋白的結合被打破,p53的穩(wěn)定性增加；p53進入細胞核內與特定的DNA序列結合,轉錄激活下游基因。p53下游基因編碼的蛋白中,有導致細胞周期停滯的CDKN1A(p21),有促進調亡發(fā)生的Bcl-2蛋白家族成員,如Bax、Puma、Noxa,等等。p53蛋白正是通

3、過轉錄激活這些基因參與決定細胞的命運。
　　 超過50％的人類惡性腫瘤與p53蛋白發(fā)生異常有關,其中最常見的異常是p53的DNA結合區(qū)發(fā)生氨基酸的突變(由TP53基因的點突變造成),使p53蛋白無法與特定的DNA序列結合,無法轉錄激活下游基因。而在攜帶wt-p53的惡性腫瘤中,Mdm2基因常發(fā)生擴增或產物過表達,使p53蛋白被快速降解而無法在核內達到足夠的水平,相比之下,突變的p53(mut-p53)蛋白不激活Mdm2的表達,因

4、而穩(wěn)定性增加。因此,打破p53-Mdm2的蛋白.蛋白相互作用從而穩(wěn)定wt-p53蛋白,恢復其抑癌功能,成為了腫瘤小分子靶向治療開發(fā)的新熱點。
　　 本研究所采用的基于p53-Mdm2多肽一蛋白復合物的晶體結構結合計算機三維藥效模型而設計并合成的小分子Mdm2抑制物(MI-219),具有競爭性結合Mdm2蛋白,游離wt-p53并使其蛋白水平上調,能夠誘導細胞周期停滯及腫瘤細胞凋亡。
　　 乳腺癌在實體瘤中TP53基因突變率

5、較低,而成人急性髓細胞性白血病(acutemyelogenous leukemia,AML)中TP53基因突變率僅約10％,故成為本研究選用的疾病模型。
　　 材料與方法：
　　 以Mdm2抑制物處理乳腺癌細胞系(MCF-7等)、良性細胞系(HMEC等)、19個AML細胞系以及從109例AML病人外周血或骨髓提純的分化障礙的白血病細胞(經(jīng)細胞離心涂片固定染色并經(jīng)鏡下細胞形態(tài)學觀察確定純度為90％以上),采用流式細胞儀檢測

6、細胞周期停滯以及調亡的發(fā)生；采用WST assay檢測細胞生長抑制情況；采用Western blotting檢測p53,p21,Mdm2,MdmX蛋白的表達；采用針對MdmX的siRNA以及Cisplatin等化療藥物下調MdmX蛋白；采用Q-PCR檢測AML臨床標本p53,Mdm2,MdmX的mRNA水平；對AML細胞株及提純后的AML病人白血病細胞的TP53外顯子5-9、NPM1基因exon12、以及Flt3-ITD基因突變進行測序

7、；采用SNP6.0 assay以及相關一系列分析軟件對病變(白血病細胞DNA)及正常(對應的頰粘膜細胞DNA)染色體17p進行比較；采用DNA甲基轉移酶抑制劑(5-azacytadine,5-aza)以及組蛋白去乙?；敢种苿?Tricostatin A,TSA)研究表觀遺傳修飾對p53基因失表達的作用。
　　 臨床資料的搜集包括每例病人的一般資料、詳細的既往病史及治療史、染色體核型及細胞遺傳學分析、病理分期、確診時外周血及骨髓

8、中白血病細胞的百分比、白血病細胞表面抗原屬性等(資料為University of Michigan Hospital所有)。
　　 結果：
　　 第一部分 MI-219抑制物通過有效上調wt-p53蛋白水平而有效誘導攜帶wt-p53的乳腺癌細胞發(fā)生細胞周期停滯以及細胞凋亡,但對正常細胞無毒性。
　　 攜帶wt-p53蛋白的乳腺癌細胞在MI-219處理后發(fā)生細胞生長抑制、G1期細胞周期停滯、以及細胞凋亡,而攜帶mu

9、t-p53蛋白的乳腺癌細胞對MI-219沒有反應。M1-219能夠上調wt-p53的蛋白水平,而不改變mut-p53的蛋白水平。攜帶wt-p53的MCF-7/Her-2(穩(wěn)定表達Her-2)細胞與其對照MCF-7/vec(空白質粒)對MI-219處理的反應沒有顯著差異。用siRNA下調MdmX蛋白的水平,或用化療藥物處理乳腺癌細胞以達到下調MdmX蛋白的目的,這兩種手段均對MI-219誘導的調亡起協(xié)同作用。MI-219能夠誘導良性細胞發(fā)

10、生細胞周期停滯,但不發(fā)生細胞凋亡。
　　 第二部分多種分子機制共同決定成人急性髓細胞性白血病對Mdm2抑制物的敏感或者抗藥。
　　 在攜帶wt-p53的AML病人當中,有大約30％病人對Mdm2抑制物發(fā)生抗藥。17號染色體短臂(17p)的中性雜和性缺失在AML病人中很常見,大多數(shù)合并TP53基因突變或不表達。TP53基因突變不能涵蓋該AML群體中所有對Mdm2抑制物抗藥的病例。至少在本研究當中,wt-p53攜帶者中,p5

11、3蛋白低表達或失表達不能被DNA甲基轉移酶抑制劑或組蛋白去乙?；敢种苿┠孓D。樣本中Mdm2或MdmX蛋白的基礎表達水平與樣本對Mdm2抑制物的IC50沒有關聯(lián)。在本研究當中,完整功能的wt-p53以及Flt3-ITD同時存在的病例對Mdm2抑制物尤為敏感。
　　 結論：
　　 第一部分:
　　 1.與正常細胞相比,乳腺癌細胞高表達Mdm2蛋白。
　　 2.Mdm2抑制物有效誘導攜帶wt-p53的乳腺癌細

12、胞發(fā)生凋亡,但對正常細胞無毒性,將很有可能成為針對攜帶wt-p53蛋白的惡性腫瘤的新型靶向治療藥物。
　　 3.Mdm2抑制物能夠有效誘導高表達Her2/neu的乳腺癌細胞發(fā)生細胞凋亡。
　　 4.下調MdmX蛋白對Mdm2抑制物所誘導的細胞凋亡起協(xié)同作用。
　　 5.Mdm2抑制物與傳統(tǒng)化療藥物聯(lián)合應用能夠協(xié)同殺死攜帶wt-p53的乳腺癌細胞。
　　 第二部分:
　　 1.對TP53突變的病人不

13、應給予Mdm2抑制物。
　　 2.不能一味地認為wt-p53的病例100％對Mdm2抑制物敏感
　　 3.聯(lián)合應用多種基因異常檢測手段檢測以TP53基因異常為主的遺傳標記物才能最大程度區(qū)分出有可能對Mdm2抑制物抵抗的病例。
　　 4.Flt3-ITD突變存在下的絕大部分AML對Mdm2抑制物極其敏感,但目前尚缺乏具備敏感性和特異性的檢測方法以有效地識別對Mdm2抑制物抵抗的病例。
　　 5.目前臨床實踐