新型青黛片對NB4、HL-60細胞的抑制作用及其機理研究.pdf

1、含雄黃的復方青黛片在臨床上用于治療急性早幼粒細胞白血病。但是，由于復方中的雄黃用量大，毒性高，生物利用度低等問題限制了它的醫(yī)用價值。為了克服這些問題，本文利用氧化亞鐵硫桿菌（Acidithiobacillus ferrooxidans,At.f）對雄黃進行轉(zhuǎn)化，并利用轉(zhuǎn)化液替代了復方青黛片中雄黃，獲得了新型青黛片(FRBS)，并對FRBS抗白血病NB4、HL-60細胞的藥效、作用機理及其毒性進行了系統(tǒng)研究。
　　MTT實驗顯示，F(xiàn)

2、RBS處理12h時，對于NB4、HL-60細胞的抑制率分別達到32.5％和46.3%；砷濃度為20μg/ml的新型青黛片(FRBS)對NB4的抑制率顯著高于砷濃度為0.8mg/ml的復方青黛片(RIF)和水飛雄黃組(Original)。同樣對于HL-60細胞，F(xiàn)RBS在砷濃度低于RIF40倍情況下，抑制細胞增殖的效果顯著高于RIF和水飛雄黃組。但是，以砷濃度為12μg/ml的FRBS處理HUVEC和RAW264.7細胞24h，對正常細胞

3、的增殖無顯著影響。
　　采用FRBS和RIF處理NB4和HL-60細胞，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA可知，與空白對照組相比，藥物處理使180-200bp之間呈現(xiàn)明顯的梯形條帶，且FRBS誘導梯形條帶的形成顯著強于RIF；由流式細胞檢測結(jié)果可知：FRBS促使NB4、HL-60細胞周期阻滯在G2期。進一步，NB4凋亡發(fā)生在早期、HL-60凋亡發(fā)生在晚期，且同樣砷濃度的FRBS誘導凋亡率顯著高于RIF；采用熒光探針Hochest3325

4、8對NB4、HL-60細胞核染色觀察發(fā)現(xiàn)，砷濃度為2μg/ml的FRBS處理后，NB4和HL-60細胞中均出現(xiàn)了凋亡小體，而RIF作用不明顯；Western-blot結(jié)果顯示，caspase-3、caspase-9和Cyt-c蛋白的表達量隨FRBS處理時間延長而增加；FRBS促進NB4細胞線粒體Cyt-c蛋白的表達量的增加顯著高于RIF。而在HL-60細胞中，caspase-3和caspase-9蛋白的表達量的增加顯著高于RIF。

5、>　　急性毒性實驗結(jié)果顯示，用FRBS、RIF和RTS給小鼠灌胃后，F(xiàn)RBS的半數(shù)致死量(LD50)為19.32mg/kg，RIF的半數(shù)致死量(LD50)為13.16mg/kg及RTS的半數(shù)致死量(LD50)為13.07mg/kg；小鼠的病理切片結(jié)果和血液指標顯示，F(xiàn)RBS對小鼠血液的各項指標無顯著影響，對小鼠臟器顯微形態(tài)結(jié)構(gòu)也無顯著影響，不損傷小鼠的臟器。
　　由此可見，F(xiàn)RBS特異性抑制NB4和HL-60細胞的增殖，不影響正常

6、細胞HUVEC和RAW264.7細胞的增殖。進一步，F(xiàn)RBS誘導NB4和HL-60細胞G2阻滯、DNA降解、凋亡小體出現(xiàn)、caspase-3、caspase-9和Cyt-c蛋白的表達量增加，進而產(chǎn)生細胞凋亡。而且，F(xiàn)RBS在砷濃度低于RIF40倍的情況下，其誘導凋亡作用顯著高于RIF；相關(guān)毒性結(jié)果顯示，F(xiàn)RBS的毒性顯著低于RIF，所有這些結(jié)果支持采用RTS替代RIF中的雄黃原粉是可行的，F(xiàn)RBS有希望成為一種新型高效低毒的復方青黛片。