RNA干擾抑制survivin表達(dá)對(duì)惡性黑素瘤生物功能的影響.pdf

1、惡性黑素瘤是皮膚科惡性程度很高的腫瘤，易轉(zhuǎn)移、預(yù)后差，發(fā)病率在國(guó)內(nèi)外呈上升趨勢(shì)。RNA干擾(RNAi)是近年迅速發(fā)展起來的一項(xiàng)基因阻斷技術(shù)，它是利用與靶基因同源的小片段雙鏈RNA(siRNA)轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞，特異性誘導(dǎo)靶基因mRNA降解。Survivin是凋亡抑制蛋白(IAP)家族的一個(gè)新成員，是至今發(fā)現(xiàn)最強(qiáng)的凋亡抑制因子。Survivin高表達(dá)于包括黑素瘤在內(nèi)的絕大多數(shù)腫瘤組織，而在分化正常的組織中沉默。Survivin具有抑制細(xì)胞凋亡和

2、調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖的雙重作用，并與腫瘤侵襲相關(guān)，是理想的抗癌治療靶位。本文通過構(gòu)建針對(duì)survivin的小干擾RNA(siRNA)表達(dá)質(zhì)粒，研究其對(duì)M14人黑素瘤細(xì)胞survivin基因表達(dá)的抑制作用，以及對(duì)黑素瘤細(xì)胞凋亡、增殖和侵襲的影響，探索黑素瘤基因治療的新途徑。全文共分為兩個(gè)部分： 第一部分：survivin小干擾RNA(siRNA)表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建、鑒定及功能研究根據(jù)survivin(Gene～Bank編號(hào)NM001168)m

3、RNA，按siRNA設(shè)計(jì)原則，由pRNAT-H1.1/neo質(zhì)粒siRNA設(shè)計(jì)軟件，設(shè)計(jì)兩對(duì)survivinsiRNA正義鏈和反義鏈，以loop(9nt)相連，形成小發(fā)夾狀RNA(shorthairpinRNA，shRNA)，合成編碼此shRNA的DNA模板雙鏈，分別將2對(duì)模板鏈煺火正義鏈和反義鏈配對(duì)結(jié)合，用T4DNA連接酶將其定向克隆至pRNAT-H1.1/neo質(zhì)粒的H1啟動(dòng)子之后，構(gòu)建成重組體質(zhì)粒。將重組體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α

4、感受態(tài)細(xì)胞，篩選抗性克隆，命名為pRNAT-H1.1/neo-survivin1＃、pRNAT-H1.1/neo-survivin2＃。酶切及測(cè)序結(jié)果證實(shí)質(zhì)粒pRNAT-H1.1/neo-survivin1＃和pRNAT-H1.1/neo-survivin2＃構(gòu)建成功。 利用脂質(zhì)體法將重組體質(zhì)粒pRNAT-H1.1/neo-survivin1＃和pRNAT-H1.1/neo-survivin2＃轉(zhuǎn)染survivin高表達(dá)細(xì)胞系人

5、黑素瘤M14細(xì)胞，用G418篩選出穩(wěn)定表達(dá)株。采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)、Westernblot分別檢測(cè)survivinmRNA和蛋白的表達(dá)，以空載體和未轉(zhuǎn)染M14為對(duì)照組。結(jié)果顯示1＃siRNA處理組M14細(xì)胞survivinmRNA、蛋白水平分別為空載體對(duì)照組的(37.7±1.5)％、(46.4±0.9)％，均顯著低于2＃siRNA處理組(63.6±3.1)％、(77.3±2.1)％(P＜0.05)。 結(jié)論：本

6、研究成功構(gòu)建survivinsiRNA表達(dá)質(zhì)粒pRNAT-H1.1/neo-survivin，該質(zhì)粒可成功阻斷人黑素瘤M14細(xì)胞survivin基因的表達(dá)。 第二部分：SurvivinsiRNA對(duì)M14人黑素瘤細(xì)胞凋亡、增殖和侵襲的影響將成功構(gòu)建的pRNAT-H1.1/neo-survivin1＃和pRNAT-H1.1/neo-survivin2＃表達(dá)質(zhì)粒，通過脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染M14人黑素瘤細(xì)胞，特異性阻斷細(xì)胞內(nèi)survivin基因

7、的表達(dá)后，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)AnnexinV-FITC標(biāo)記的凋亡細(xì)胞，結(jié)果顯示空載體對(duì)照組、pRNAT-H1.1/neo-survivin1＃組和pRNAT-H1.1/neo-survivin2＃組相對(duì)于M14術(shù)處理組的凋亡率分別為：0.92％、21.30％、9.82％。 用噻唑藍(lán)(MTT)法分析細(xì)胞增殖，結(jié)果顯示空載體組、轉(zhuǎn)染pRNAT-H1.1/neo-survivin1＃和pRNAT-H1.1/neo-survivin2＃組

8、的細(xì)胞抑制率，在不同時(shí)間均具有顯著差異(P＜0.05)，第四天各組細(xì)胞的抑制率：pRNAT-H1.1/neo-survivin1＃組為(55.4±4.3)％，與pRNAT-H1.1/neo-survivin2＃組(34.5±4.2)％和空載體組(13.3±4.6)％比較有顯著性差異(P＜0.05)。分析發(fā)現(xiàn)阻斷M14細(xì)胞內(nèi)survivin的表達(dá)具有抑制細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡的雙重作用。 用Transwell法分析細(xì)胞侵襲能力，將

9、pRNAT-H1.1/neo-survivin1＃、pRNAT-H1.1/neo-survivin2＃和空載體轉(zhuǎn)染M14細(xì)胞后顯示，穿膜細(xì)胞數(shù)分別為M14細(xì)胞組的(44.1±2.3)％、(75.4±4.1)％和(92.1±6.1)％，表明survivinsiRNA可明顯降低M14人黑素瘤細(xì)胞的侵襲能力。 結(jié)論：靶向survivin的siRNA表達(dá)質(zhì)粒可誘導(dǎo)黑素瘤細(xì)胞凋亡并顯著抑制細(xì)胞的增殖和侵襲，其中pRNAT-H1.1/neo