惡性黑素瘤VEGF和eNOS的表達以及VEGF-siRNA對其生長抑制的實驗研究.pdf

1、第一部分:惡性黑素瘤VEGF和eNOS的表達及其與腫瘤血管生成的關(guān)系 目的:研究血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)在惡性黑素瘤組織中的表達，以及與惡性黑素瘤血管生成的關(guān)系，探討eNOS產(chǎn)生的一氧化氮(NO)在介導(dǎo)VEGF促腫瘤血管生成中的作用機制。 方法:應(yīng)用免疫組織化學方法檢測31例惡性黑素瘤組織eNOS、VEGF和血管內(nèi)皮細胞特異性第Ⅷ因子相關(guān)抗原(FⅧRAg)的表達，依據(jù)FⅧRAg的表達評

2、價腫瘤微血管密度(MVD)，并且以30例色素痣組織作為對照研究。 結(jié)果:①在31例惡性黑素瘤組織中，24例表達eNOS，26例表達VEGF，而在色素痣組織未檢測到eNOS和VEGF的表達；②在惡性黑素瘤組織中，VEGF與eNOS的表達呈正相關(guān)；③在惡性黑素瘤組織中，eNOS、VEGF的表達與MVD呈正相關(guān)，且惡性黑素瘤MVD明顯高于色素痣；④在惡性黑素瘤組織中eNOS、VEGF表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)。 結(jié)論:①VEGF和e

3、NOS可作為區(qū)別良、惡性黑素細胞腫瘤的重要指標；②在惡性黑素瘤中MVD隨著VEGF和eNOS表達的增強而增加，提示兩者可促進惡性黑素瘤血管生成；③eNOS在VEGF調(diào)節(jié)腫瘤血管生成中可能具有重要作用。 第二部分:VEGF的表達對惡性黑素瘤細胞增殖的影響及其機制 目的:觀察VEGF表達對惡性黑素瘤細胞增殖的影響，以及一氧化氮(NO)及一氧化氮合酶(NOS)在其中所起的作用，以探討VEGF促進惡性黑素瘤細胞增殖的作用機制。

4、 方法:通過電穿孔法將VEGF165cDNA和空載體分別轉(zhuǎn)染至惡性黑素瘤細胞系A(chǔ)375中，并設(shè)未轉(zhuǎn)染細胞作為對照。采用細胞計數(shù)法和酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)分別檢測上述處理的A375細胞體外增殖效應(yīng)及其分泌的VEGF含量，蛋白印跡(WesternBlot)實驗檢測上述處理細胞合成的誘導(dǎo)型、內(nèi)皮型、神經(jīng)型一氧化氮合酶(iNOS、eNOS、nNOS)的蛋白表達，用硝酸還原酶法檢測上述處理細胞培養(yǎng)上清中NO含量，MTT法檢測一氧化氮

5、合酶抑制劑N-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME)對轉(zhuǎn)染VEGF165cDNA后A375細胞的增殖影響。 結(jié)果:與對照組相比，轉(zhuǎn)染VEGFi65cDNA的A375細胞的增殖能力明顯增強(P＜0.05)，轉(zhuǎn)染后72h、96h其VEGF的分泌明顯增加(P＜0.01)，轉(zhuǎn)染后48h、72h、96h其iNOS蛋白的合成和NO的釋放明顯升高(P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01)，但在實驗組和對照組中均未檢測到eNOS和nNOS蛋白表

6、達，L-NAME對轉(zhuǎn)染VEGF165cDNA72h后的A375細胞增殖具有抑制作用，并顯示劑量依賴性(P＜O.01)。 結(jié)論:內(nèi)源性VEGF可能通過自分泌方式促進A375細胞增殖，其促進A375細胞增殖作用可能與iNOS產(chǎn)生的NO密切相關(guān)。 第三部分:pU-VEGF-siRNA表達載體的構(gòu)建及鑒定 目的:構(gòu)建針對VEGF的發(fā)卡樣siRNA真核表達載體pU-VEGF-siRNA，并導(dǎo)入惡性黑素瘤細胞，探討其在體外培

7、養(yǎng)惡性黑素瘤細胞中對VEGF的干擾作用。 方法:人工合成一對互補并編碼相應(yīng)短發(fā)夾狀VEGF-siRNA的寡核苷酸鏈，將其插入到pSilencerTM2.1-U6neo載體中，經(jīng)測序鑒定所構(gòu)建的重組體是否正確；采用電轉(zhuǎn)染方法將構(gòu)建重組體導(dǎo)入人惡性黑素瘤細胞系A(chǔ)375和人結(jié)直腸癌細胞系LOVO細胞中，用G418篩選得到穩(wěn)定表達VEGF-siRNA的細胞；采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)、ELISA分別檢測轉(zhuǎn)染細胞VEGFmRN

8、A和蛋白的表達變化。結(jié)果經(jīng)測序證明pU-VEGF-siRNA序列正確；G418篩選得到穩(wěn)定表達VEGF-siRNA的細胞；轉(zhuǎn)染pU-VEGF-siRNA載體后，A375和LOVO細胞VEGFmRNA和蛋白表達均較對照組明顯下降(P＜O.01)。 結(jié)論:L測序結(jié)果表明發(fā)卡樣的VEGF-siRNA真核表達載體構(gòu)建成功，轉(zhuǎn)染A375和LOVO細胞后獲得穩(wěn)定表達，并可特異性封閉VEGF的表達，為進一步研究pU-VEGF-siRNA載體在

9、惡性黑素瘤治療中的作用提供了實驗基礎(chǔ)。 第四部分:pU-VEGF-siRNA對惡性黑素瘤細胞生物學行為影響的實驗研究 目的:研究pU-VEGF-siRNA體外對A375和LOVO細胞的增殖和凋亡，及其體內(nèi)對惡性黑素瘤成瘤和凋亡的影響，以期為臨床惡性黑素瘤的治療提供理論依據(jù)和實驗數(shù)據(jù)。 方法:采用細胞計數(shù)法檢測實驗組和對照組A375和LOVO細胞增殖，并將含實驗組和對照組A375細胞培養(yǎng)上清的培養(yǎng)液分別培養(yǎng)人靜脈內(nèi)

10、皮細胞(ECV-304)，觀察ECV-304生長情況；用流式細胞術(shù)(FCM)檢測轉(zhuǎn)染pU-VEGF-siRNA載體的A375細胞凋亡；應(yīng)用免疫組織化學方法檢測裸鼠腫瘤組織VEGF和血管內(nèi)皮細胞特異性第Ⅷ因子相關(guān)抗原(FⅧRAg)的表達，依據(jù)FⅧRAg的表達評價腫瘤微血管密度(MVD)；末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶標記法(TUNEL)定量檢測pU-VEGF-siRNA轉(zhuǎn)染細胞裸鼠模型的腫瘤組織凋亡。 結(jié)果:實驗組A375細胞增殖較對照組明

11、顯減慢(P＜0.01)，其細胞周期出現(xiàn)亞二倍體凋亡峰，而LOVO細胞的增殖與對照組比較無明顯差異(P＞0.05)，對照組A375細胞培養(yǎng)上清對ECV-304細胞的增殖具有明顯的促進作用，而實驗組A375細胞培養(yǎng)上清對其促增殖作用顯著降低(P＜0.01)；體內(nèi)實驗證明，實驗組成瘤率顯著低于對照組(P＜0.05)，且其腫瘤生長速度也明顯減慢(P＜0.01)，實驗組VEGF表達和MVD明顯低于對照組(P＜0.01)，實驗組可見大量凋亡細胞，對