shRNA沉默VEGF表達(dá)對(duì)肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)作用和機(jī)理的研究.pdf

1、背景與目的：腫瘤的生長(zhǎng)依賴于血管的新生，抑制腫瘤血管生成已經(jīng)成為腫瘤治療的一種策略。VEGF與其受體（VEGFR）結(jié)合，從而開(kāi)始信號(hào)傳導(dǎo)，觸發(fā)一系列相關(guān)的反應(yīng)，最終導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂，并且刺激其增殖及形成血管。VEGF/VEGFR通路不僅能夠特定的使內(nèi)皮細(xì)胞分裂、增生，在血管形成、血管通透性的增加以及受損神經(jīng)元的保護(hù)等方面也其參與，而且在缺血性腦血管病的損傷和抗損傷過(guò)程中也起重要作用。它還有使微小血管的通透性增加、更能夠使起源各異

2、的內(nèi)皮細(xì)胞分裂、增生、繁殖并且形成血管、而且還能夠讓內(nèi)皮細(xì)胞游走、移動(dòng)等各種作用。許多腫瘤細(xì)胞都能夠使VEGF的表達(dá)水平升高，而且腫瘤細(xì)胞的惡性程度和VEGF的表達(dá)水平成正比，因此，目前在抵抗腫瘤血管形成的治療方案中，VEGF和VEGFR作為靶分子最為成熟。
　　RNA干擾(RNAinterference，RNAi)就是一種沉默基因的機(jī)制，它通過(guò)雙鏈RNA(doublestrandedRNA，dsRNA)引起，并且能夠在轉(zhuǎn)錄后沉默

3、基因。它是轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的一種，其在沉默同源基因的表達(dá)中，能夠發(fā)揮特異性和高效性。在功能基因組研究中，該技術(shù)起到了重要的作用。在疾病的治療中，它也是一種潛在的手段，是通過(guò)特異性基因沉默來(lái)實(shí)現(xiàn)的。尤其在腫瘤的干預(yù)中更具有潛在意義。目前，通過(guò)RNAi技術(shù)干涉VEGF的表達(dá)能夠抑制胰腺癌、喉鱗癌、大腸癌和肺癌等細(xì)胞株的增殖、生長(zhǎng)、侵襲和遷移。
　　本課題，我們利用RNAi干涉技術(shù)，沉默肺癌細(xì)胞中VEGF的表達(dá)，從而達(dá)到干預(yù)肺癌生長(zhǎng)增殖的目的

4、，為肺癌的基因治療提供新的理論依據(jù)。期望能夠獲得一個(gè)持續(xù)高效的抑制肺癌細(xì)胞中VEGF表達(dá)的RNAi片段，從體外、內(nèi)觀察其對(duì)肺癌細(xì)胞增殖和肺內(nèi)癌腫生長(zhǎng)的影響，并探討其干預(yù)機(jī)制。
　　材料和方法：通過(guò)篩選獲得理想的能夠沉默肺癌細(xì)胞中VEGF表達(dá)的shRNA片段，并將其插入到載體中，制備成pSilencer-VEGF-shRNA；體外利用該質(zhì)粒對(duì)肺癌A549細(xì)胞系進(jìn)行干預(yù)后，動(dòng)態(tài)觀察A549細(xì)胞中VEGF的表達(dá)、肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)及內(nèi)皮細(xì)胞

5、小管結(jié)構(gòu)的形成；用A549和pSilencer-VEGF-A549細(xì)胞分別接種裸鼠，觀察荷瘤裸鼠體內(nèi)腫瘤組織的生長(zhǎng)及生存期。使用RT-PCR和免疫印跡的方法檢測(cè)與內(nèi)皮細(xì)胞相互作用后干涉VEGF的A549細(xì)胞內(nèi)p53、Bcl-2和Bax轉(zhuǎn)錄和蛋白水平上的變化。
　　研究結(jié)果：經(jīng)RT-PCR和免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)pSilencer-VEGF-2對(duì)肺癌細(xì)胞中VEGF的抑制率能夠達(dá)到90％以上；在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的肺癌細(xì)胞株A549細(xì)胞中，2個(gè)月

6、以后對(duì)VEGF的抑制率仍在80％以上；肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)干預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，pSilencer-VEGF-2明顯抑制了肺癌A549細(xì)胞系中VEGF的表達(dá)；雖然穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pSilencer-VEGF-2的肺癌A549細(xì)胞株體外生長(zhǎng)未發(fā)生明顯變化，但是，它可以顯著抑制內(nèi)皮細(xì)胞的血管生成作用。體內(nèi)荷瘤裸鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與接種對(duì)照組荷肺癌A549細(xì)胞株瘤的裸鼠相比，pSilencer-VEGF-2-A549荷瘤裸鼠體內(nèi)腫瘤組織的生長(zhǎng)顯著減慢（P＜0.05

7、），生存期明顯延長(zhǎng)（P＜0.05）。pSilencer-VEGF-2干預(yù)肺癌增殖生長(zhǎng)的機(jī)制研究顯示，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的人肺癌A549細(xì)胞株中P53，Bcl-2和Bax的表達(dá)無(wú)明顯改變，也未見(jiàn)到明顯的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。與對(duì)照組相比，在人HUVEC細(xì)胞系的作用下，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的人A549細(xì)胞中Bax表達(dá)無(wú)變化，但P53的表達(dá)明顯增高，Bcl-2的表達(dá)下調(diào)，且有細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。
　　結(jié)論：我們篩選構(gòu)建了理想的、能夠有效抑制肺癌VEGF表達(dá)的shRNA質(zhì)粒