HPSE-1和VEGF的相互上調-一種觸發(fā)惡性黑素瘤進展的新型機制.pdf

1、惡性黑素瘤（Malignantmelanoma，MM），作為來源于黑素細胞（Melanocyte，MC）的惡性腫瘤，是目前侵襲性最強、致死率最高的皮膚惡性疾病。轉移性MM更是對所有的治療策略都存在耐受，預后極差，5年生存率低，對人類造成了極大的危害。但是，MM如何進展為一種高度攻擊性疾病的相關機制卻仍被人們知之甚少。
　　乙酰肝素酶（Heparanase，HPSE-1），一種哺乳動物的β-葡萄糖醛酸內切酶，在多種惡性腫瘤的侵襲、轉

2、移、預后和低生存率中扮演著重要的角色。HPSE-1由于具有酶解基底膜（Basementmembrane，BM）和細胞外基質（Extracellularmatrix，ECM）的主要成分——硫酸乙酰肝素多糖鏈（Heparansulfateproteoglycans，HSPGs）的活性，參與ECM的降解和重塑，因此HPSE-1表達的升高與腫瘤進展的關系非常密切，反之，下調HPSE-1的表達已成為惡性腫瘤的有效治療策略。雖然，HPSE-1在腫瘤

3、中的研究已取得很大的進展，但HPSE-1促進腫瘤發(fā)展的機制尚有很多問題亟待探討。
　　許多證據(jù)表明，HPSE-1與諸多生長因子的關系密切，很可能與腫瘤進展相關。HPSE-1主要通過其胞外的酶解活性和參與胞內信號轉導，調節(jié)生長因子的表達和活性。而在生長因子中，血管內皮生長因子（vascularendothelialgrowthfactor，VEGF），作為一個與血管形成密切相關的關鍵因子，是腫瘤進展和轉移所必需的。因此，我們做出如下

4、推測：HPSE-1一方面可降解HSPGs從而釋放在ECM寄居的VEGF，另一方面，HPSE-1可通過參與細胞信號轉導來誘導VEGF的表達；繼而VEGF的釋放和表達增高可促使與受體的結合，從而啟動相關信號途徑，這些途徑的激活可上調與細胞增生、存活、侵襲和轉移相關的核內轉錄因子，而在這些因子中，其中有部分可通過結合HPSE-1的啟動子而調節(jié)HPSE-1的轉錄和表達。據(jù)此，VEGF在腫瘤中極可能具有尚未被發(fā)現(xiàn)的調節(jié)HPSE-1表達的功能。

5、r>　　根據(jù)以上的論述，我們假設HPSE-1和VEGF在MM中存在雙向相互上調關系，而此關系作為一種新型機制很可能在MM的進展中起著決定性的作用。本研究的目的在于證實HPSE-1和VEGF的相互上調關系存在于MM，并闡明此種關系對MM細胞的惡性生物學行為所產(chǎn)生的效應和影響，為進一步揭示MM的發(fā)病機制、拓寬MM的治療策略提供新的思路和理念。
　　實驗一 HPSE-1和VEGF在MM細胞存在雙向上調關系方法和結果：
　?、佥d體構

6、建和鑒定：經(jīng)酶切和測序鑒定，成功構建了HPSE-1的SiRNA表達載體；
　?、诩毎霓D染和目的基因表達的鑒定：成功篩選出穩(wěn)定轉染HPSE-1表達載體和VEGF表達載體的A2058細胞系，并經(jīng)鑒定，各轉染目的基因的表達在mRNA和蛋白水平均有顯著的升高，而瞬時轉染二者SiRNA載體的細胞，也顯示了對目的基因的明顯抑制效應；
　　③HPSE-1對VEGF表達的調控：當上調HPSE-1的表達時，VEGF的熒光定量PCR、West

7、ern-blot及ELISA結果均顯示，VEGF的表達水平隨之升高；而抑制HPSE-1的表達時，VEGF的表達水平隨之降低，說明HPSE-1可調節(jié)VEGF的表達；
　?、躒EGF對HPSE-1表達的調控：當通過表達載體、SiRNA的轉染以及外源性VEGF的加入來調控VEGF后，HPSE-1的表達水平無論在mRNA還是蛋白水平均出現(xiàn)相應的變化，提示VEGF反過來也可調節(jié)HPSE-1的表達；
　?、軵D98059對二者相互上調關

8、系的影響：應用MEK/ERK的特異性抑制劑——PD98059分別作用于表達HPSE-1和VEGF的穩(wěn)定轉染細胞系，HPSE-1和VEGF的相互上調均出現(xiàn)不完全的阻滯，同時MEK/ERK信號通路的激活狀態(tài)也得到抑制。
　　結論：
　　首次體外發(fā)現(xiàn)MM細胞中HPSE-1和VEGF存在雙向上調關系，而這種雙向上調可被MEK/ERK信號通路的抑制劑PD98059不完全的阻滯。
　　實驗二 HPSE-1與VEGF的雙向上調關系對

9、
　　MM細胞的惡性生物學行為的影響
　　方法和結果：
　　①細胞增殖活性檢測：MTT實驗結果發(fā)現(xiàn)HPSE-1和VEGF的轉染可提高A2058細胞的增殖能力，而PD98059對此有抑制效應；
　?、诩毎忠u力檢測：Transwell侵襲實驗的結果與MTT的結果基本一致，HPSE-1和VEGF的轉染細胞組透過微孔膜細胞數(shù)明顯高于對照組，但可被PD98059阻滯；
　?、勐闶蟪闪鰧嶒灒簩⒏鹘M腫瘤組織稱重，結果顯

10、示HPSE-1和VEGF的轉染細胞組，分別給予VEGF的中和單抗——Avastin干預后，其腫瘤重量均明顯減?。?br>　?、芰鼋M織形態(tài)學觀察：轉染HPSE-1細胞組的瘤組織行HE染色，發(fā)現(xiàn)未加入Avastin組細胞生長狀態(tài)較好，瘤體中間有微血管形成，而加入Avastin組，腫瘤細胞壞死明顯，瘤體內可見片狀壞死區(qū)，說明HPSE-1所誘導產(chǎn)生的VEGF被Avastin中和，腫瘤血管生成障礙；
　?、萘鼋M織HPSE-1的mRNA水平檢

11、測：轉染VEGF的A2058細胞接種裸鼠體內，在給予Avastin后，中和VEGF的同時，降低了HPSE-1的mRNA水平，說明在體VEGF對HPSE-1的表達仍然具有調控作用。
　　結論：
　　體內和體外研究均發(fā)現(xiàn)HPSE-1和VEGF的雙向上調可促進MM細胞增殖、侵襲和生長速度；體外應用PD98059或體內應用Avastin，即打斷二者的相互聯(lián)系，可降低和抑制HPSE-1和VEGF的相互上調所賦予MM細胞的高度增殖、侵襲