膽囊癌轉(zhuǎn)移機(jī)制研究.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)?zāi)康模翰捎肎BC-SD細(xì)胞，建立膽囊癌實(shí)驗(yàn)性肝轉(zhuǎn)移模型并通過模型篩選高轉(zhuǎn)移亞群細(xì)胞，旨在為膽囊癌肝轉(zhuǎn)移的研究提供一個(gè)體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)工具；采用轉(zhuǎn)移相關(guān)基因表達(dá)芯片，通過分析不同轉(zhuǎn)移能力膽囊癌細(xì)胞亞群的轉(zhuǎn)移相關(guān)基因表達(dá)的差異，識別哪些基因與膽囊癌轉(zhuǎn)移相關(guān)，旨在更好的了解膽囊癌轉(zhuǎn)移分子機(jī)制，并在膽囊癌轉(zhuǎn)移干預(yù)時(shí)，對有關(guān)靶分子選擇方面提供一些有價(jià)值的線索。 方法一、膽囊癌轉(zhuǎn)移模型：GBC-SD細(xì)胞在含10％胎牛血清的RPMI164

2、5培養(yǎng)液中培養(yǎng)，在單層細(xì)胞將鋪滿瓶底前用胰蛋白酶收獲，生理鹽水制備細(xì)胞懸液1×106，4到6周齡裸小鼠脾臟接種。 二、膽囊癌高轉(zhuǎn)移亞群細(xì)胞：從形成肝轉(zhuǎn)移的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肝臟中分離腫瘤細(xì)胞，體外培養(yǎng)，采用同樣的方法建立轉(zhuǎn)移模型作第二輪篩選。再重復(fù)以上步驟進(jìn)行第三輪篩選，分離出高轉(zhuǎn)移表型膽囊癌細(xì)胞亞群，命名為GBC-SD/M3。為明確其組織學(xué)來源和遺傳背景，GBC-SD/M3與GBC-SD在倒置顯微鏡下觀察形態(tài)特征；同時(shí)，抽提兩者與實(shí)驗(yàn)動(dòng)

3、物肝組織DNA，PCR擴(kuò)增三對人類特異的微衛(wèi)星序列。 三、轉(zhuǎn)移相關(guān)基因差異表達(dá)和表達(dá)差異最大基因克隆、測序：分別抽提兩組細(xì)胞總mRNA用于合成cDNA探針；按照產(chǎn)品詳細(xì)說明進(jìn)行純化、雜交、化學(xué)發(fā)光信號檢測；掃描信號點(diǎn)陣圖像并存儲為TIFF灰度格式，軟件ScanAlyze和GEArrayAnalyzer對其量化。比較GBC-SD/M3和GBC-SD兩組細(xì)胞之間各基因轉(zhuǎn)錄相對豐度，篩選出轉(zhuǎn)錄差異超過二倍或兩倍以上的基因。采用特異設(shè)計(jì)

4、的引物和梯度PCR擴(kuò)增GBC-SD和GBC-SD/M之間表達(dá)差異最大基因的全長編碼序列。純化后PCR產(chǎn)物和克隆載體連接構(gòu)成重組質(zhì)粒，用于測序分析。完成生物信息學(xué)研究，采用DNASIS對所測序列進(jìn)行剪接、ORF查找、翻譯。采用在線BLAST，在NCBI核酸庫中查新和序列匹配比較。 結(jié)果： 一、膽囊癌肝臟轉(zhuǎn)移模型：應(yīng)用GBC-SD細(xì)胞，我們成功建立了裸小鼠肝臟轉(zhuǎn)移模型。轉(zhuǎn)移灶可分布肝實(shí)質(zhì)各處，但以邊緣為主。左葉多受侵犯，部分

5、全肝轉(zhuǎn)移。組織學(xué)觀察轉(zhuǎn)移病灶為腺癌。 二、膽囊癌高轉(zhuǎn)移亞群細(xì)胞：由GBC-SD細(xì)胞建立的轉(zhuǎn)移模型用于第一輪高轉(zhuǎn)移亞群細(xì)胞篩選。利用前一輪模型中轉(zhuǎn)移灶的篩選瘤細(xì)胞，連續(xù)建立另外兩代膽囊癌肝臟轉(zhuǎn)移模型，作第2、3次循環(huán)篩選。結(jié)果顯示，第一輪、第二輪、第三輪在接種后10周、7周、5周形成肉眼轉(zhuǎn)移灶，轉(zhuǎn)移率為60、70、90％。從第三輪轉(zhuǎn)移灶中篩選高轉(zhuǎn)移膽囊癌細(xì)胞亞群，命名為GBC-SD/M3。與親代細(xì)胞GBC-SD相比，所篩選的GBC

6、-SD/M3在倒置顯微鏡下具有相似的形態(tài)特征。GBC-SD、GBC-SD/M3在微衛(wèi)星D14S68□D18S69□D20S199位點(diǎn)擴(kuò)增產(chǎn)物片段完全相同，荷瘤裸鼠肝臟沒有擴(kuò)增出相應(yīng)的產(chǎn)物片段。 三、轉(zhuǎn)移相關(guān)基因表達(dá)差異：腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因芯片所檢測96個(gè)轉(zhuǎn)移相關(guān)基因中，GBC-SD和GBC-SD/M3之間有32個(gè)基因表達(dá)差異。其中，上調(diào)基因浙江大學(xué)附屬第二醫(yī)院肝膽外科博士后出站報(bào)告7包括整合素α亞基、血小板/內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子(CD

7、31，Platelet/endothelialcelladhesionmolecule)、MUC18、BrMS1、KAI1、KISS1、MMP1、MMP2、MMP16、彈性蛋白酶(Elastase)、透明質(zhì)酸酶(Hyaluronidases)、磷酸肌醇3激酶(Phosphoinositide-3-kinase，PI3K)、尿激酶(urokinase，uPA)、PAI-2(PlasminogenactivatorinhibitorPAI-

8、1)、Maspin(Serineproteinaseinhibitor)。下調(diào)的基因包括MUC1、細(xì)胞間粘附分子5(intercellularadhesionmolecule5，ICAM-5)、DCC、MCH6/APAF3(apoptosis-relatedcysteineprotease半光氨酸酶)、焦磷酸鹽/磷酸二酯酶(autotaxin，ATX)、肝素酶(Heparanases)。Maspin基因在兩組細(xì)胞中表達(dá)差異達(dá)80倍，是表

9、達(dá)差異最大基因。對該基因的克隆和測序結(jié)果沒有發(fā)現(xiàn)編碼序列突變。 結(jié)論 一、本實(shí)驗(yàn)建立膽囊癌肝轉(zhuǎn)移模型屬于實(shí)驗(yàn)性轉(zhuǎn)移模型，確切的模擬了膽囊癌細(xì)胞從血流擴(kuò)散到肝臟并最終形成轉(zhuǎn)移灶的自然過程。雖然該模型不能反映腫瘤細(xì)胞從原發(fā)部位脫離到侵入血管的前期轉(zhuǎn)移步驟，也不能反映膽囊癌淋巴轉(zhuǎn)移的過程。但對于進(jìn)行膽囊癌體內(nèi)轉(zhuǎn)移研究，仍是一個(gè)方便、可靠和有效的效工具。 二、從該轉(zhuǎn)移模型中三輪循環(huán)中篩選出高轉(zhuǎn)移膽囊癌細(xì)胞亞群GBC-SD

10、/M3，與親代細(xì)胞GBC-SD相比，GBC-SD/M3除了在形態(tài)和遺傳背景保留一致性，具有更高轉(zhuǎn)移能力，是深入進(jìn)行體外研究膽囊癌轉(zhuǎn)移的一個(gè)重要工具。 三、比較高轉(zhuǎn)移亞群和親代細(xì)胞之間的轉(zhuǎn)移相關(guān)基因差異表達(dá)結(jié)果提示，多基因表達(dá)改變與膽囊癌血行轉(zhuǎn)移有關(guān)，涉及到癌細(xì)胞與基質(zhì)的粘附、癌細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞粘附、細(xì)胞外基質(zhì)降解和降解抑制、轉(zhuǎn)移抑制等轉(zhuǎn)移多環(huán)節(jié)。這些結(jié)果所提供的線索可能有助于膽囊癌轉(zhuǎn)移預(yù)測和干預(yù)策略的制定。其中，Maspin是