miRNA-7對鼻咽癌5-8F細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響.pdf

1、目的：
　　探究過表達(dá)微小RNA（microRNA-7，miRNA-7）抑制鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)5-8F細(xì)胞惡性生物學(xué)行為活動及其與EGFR/PI3K/Akt信號傳遞通路的關(guān)聯(lián)情況。
　　方法：
　　1、5-8F細(xì)胞的培養(yǎng)和細(xì)胞轉(zhuǎn)染及細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的檢測
　　培養(yǎng)鼻咽癌5-8F細(xì)胞株，應(yīng)用Lipo2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染，24h后測算各實(shí)驗(yàn)組的轉(zhuǎn)染情況。分miRNA-7組、NC

2、組及Mock組3個實(shí)驗(yàn)組。
　　2、RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染后miRNA-7的表達(dá)
　　利用qRT-PCR實(shí)驗(yàn)法檢測轉(zhuǎn)染24h后，miRNA-7在各組5-8F細(xì)胞中的對應(yīng)表達(dá)量。
　　3、CCK-8法檢測細(xì)胞增殖能力
　　轉(zhuǎn)染各組5-8F細(xì)胞，采用CCK-8實(shí)驗(yàn)法來分別檢測各實(shí)驗(yàn)組鼻咽癌5-8F細(xì)胞株的增殖受抑制情況。
　　4、平板克隆實(shí)驗(yàn)法檢測5-8F細(xì)胞克隆形成情況
　　培養(yǎng)鼻咽癌5-8F細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后

3、運(yùn)用平板克隆實(shí)驗(yàn)法檢測各組鼻咽癌5-8F細(xì)胞克隆形成能力的改變情況。
　　5、Hoechst33258染色實(shí)驗(yàn)法檢測各實(shí)驗(yàn)組5-8F細(xì)胞凋亡情況
　　轉(zhuǎn)染各組鼻咽癌5-8F細(xì)胞，并選用Hoechst33258熒光染色實(shí)驗(yàn)法處理各實(shí)驗(yàn)組5-8F細(xì)胞，分別觀測轉(zhuǎn)染后各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的凋亡變化情況。
　　6、Transwell法檢測各組細(xì)胞遷移
　　利用Transwell小室實(shí)驗(yàn)法來分別檢測經(jīng)轉(zhuǎn)染處理后的各組鼻咽癌5-8F

4、細(xì)胞的細(xì)胞遷移能力的變化情況。
　　7、RT-PCR檢測EGFR/PI3K/Akt信號通路各成員mRNA的表達(dá)
　　利用qRT-PCR實(shí)驗(yàn)法分別檢測轉(zhuǎn)染miRNA-7模擬物對各組5-8F細(xì)胞EGFR/PDK/Akt信號傳遞通路各成員mRNA表達(dá)量改變的影響。
　　8、Western blot檢測各蛋白表達(dá)情況
　　使用Western blotting實(shí)驗(yàn)技術(shù)來分別檢測轉(zhuǎn)染miRNA-7模擬物對各組5-8F細(xì)胞EG

5、FR/PI3K/Akt信號通路各家族成員蛋白表達(dá)量改變的影響。
　　9、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　結(jié)果選用SPSS19.0進(jìn)行分析。以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)來表示計(jì)量資料，運(yùn)用單因素方差分析(ANOVA)對結(jié)果進(jìn)行檢驗(yàn)，組間采用LSD法進(jìn)行兩兩比較。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1、細(xì)胞轉(zhuǎn)染情況
　　轉(zhuǎn)染帶有Cy3熒光蛋白的Cy3-NC或Cy3-miRNA-724 h后，觀察到轉(zhuǎn)染效率

6、在85％左右。
　　2、miRNA-7在5-8F細(xì)胞中的表達(dá)情況
　　miRNA-7在miRNA-7組、NC組及空白對照組中相對表達(dá)量分別為677±4.58、1.08±0.01和0.99±0.02，miRNA-7組相對NC組及Mock組呈明顯上調(diào)(P＜0.01)。
　　3、miRNA-7對5-8F細(xì)胞增殖抑制情況
　　miRNA-7組、NC組及Mock組的A值分別為0.74±0.02、0.93±0.02和0.95

7、±0.01，miRNA-7組的A值與另外兩組相比，有顯著性差異(P＜0.01)。
　　4、miRNA-7對5-8F細(xì)胞平板克隆形成能力的影響
　　miRNA-7組克隆斑形成數(shù)量與NC組和Mock組相比明顯減少，細(xì)胞的克隆形成能力受到明顯的抑制。
　　5、miRNA-7對5-8F細(xì)胞凋亡形成的影響情況
　　Mock和NC組鼻咽癌5-8F細(xì)胞經(jīng)Hoechst33258染色后可見細(xì)胞核大小較均一，呈現(xiàn)橢圓形或者圓形，細(xì)

8、胞核內(nèi)的染色質(zhì)分布較均勻，細(xì)胞呈現(xiàn)為淡藍(lán)色熒光團(tuán);而miRNA-7組細(xì)胞內(nèi)部可見核染色質(zhì)聚集成塊且分布較不均勻，呈團(tuán)塊樣分布，有些細(xì)胞核明顯皺縮減小，有的細(xì)胞核碎裂呈小團(tuán)塊樣，大量的凋亡期細(xì)胞出現(xiàn)，可見亮藍(lán)色的細(xì)胞核固縮和碎裂分葉狀細(xì)胞核。
　　6、miRNA-7改變5-8F細(xì)胞遷移能力的情況
　　細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示miRNA-7組OD值為0.36±0.01，NC組為0.59±0.02，Mock組為0.61±0.02，mi

9、RNA-7組與NC組及空白對照組OD值差異顯著(P＜0.01)。
　　7、miRNA-7對EGFR、PI3K及AKT的mRNA表達(dá)的影響
　　RT-PCR檢測結(jié)果顯示miRNA-7組EGFR、PI3K及AKT的表達(dá)量相對于Mock組分別為0.66±0.04、0.65±0.02和0.76±0.03，而NC組則為0.95±0.02、0.91±0.03和0.93±0.02，方差分析結(jié)果顯示miRNA-7組5-8F細(xì)胞中EGFR/P

10、I3K/AKT通路各成員的mRNA表達(dá)量與NC組和Mock組相比均明顯下調(diào)，差異具有顯著性意義(P＜0.01)。
　　8、miRNA-7對EGFR/PI3K/AKT通路各蛋白表達(dá)的影響
　　Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示miRNA-7組EGFR、p-EGFR、PI3K、AKT及p-AKT的相對內(nèi)參的表達(dá)量分別為0.37±0.03、0.27±0.02、0.10±0.01、0.19±0.02和0.09±0.01，NC組為0

11、.68±0.02、0.56±0.03、0.26±0.02、0.61±0.01和0.45±0.03，Mock組則分別為0.73±0.02、0.53±0.01、0.24±0.01、0.62±0.02和0.41±0.01，應(yīng)用ANOVA進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì)，結(jié)果表明miRNA-7組5-8F細(xì)胞中EGFR/PI3K/AKT傳遞通路各成員的蛋白表達(dá)量與NC組和Mock組相比均顯著減少，差異具有顯著性意義（P＜0.01）。
　　結(jié)論：
　　1、

12、各實(shí)驗(yàn)組鼻咽癌5-8F細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率在85％作用，且轉(zhuǎn)染后miRNA-7明顯上調(diào)，并在細(xì)胞內(nèi)呈現(xiàn)過表達(dá)狀態(tài)。
　　2、轉(zhuǎn)染過量miRNA-7后，鼻咽癌5-8F細(xì)胞的增殖、平板克隆及遷移能力受到明顯抑制，而其凋亡過程卻加速進(jìn)展。
　　3、過表達(dá)的miRNA-7，可以使鼻咽癌5-8F細(xì)胞中EGFR/PI3K/AKT信號傳遞通路各主要相關(guān)成員EGFR、PI3K及AKT的mRNA及蛋白表達(dá)量均明顯下調(diào)。
　　4、轉(zhuǎn)染NC無關(guān)序列