鼻咽癌細(xì)胞株5-8F和6-10B中成瘤和轉(zhuǎn)移分子機(jī)制的初步研究.pdf

1、研究背景和目的：
　　 鼻咽癌(NasoPharyngeal Carcinoma,NPC)是我國(guó)南方五省及東南亞地區(qū)高發(fā)的頭頸部惡性腫瘤之一,它的發(fā)病是一個(gè)多基因參與、多途徑作用、多階段逐漸演變的過(guò)程,涉及了一些關(guān)鍵的瘤基因和抑瘤基因,但其發(fā)病的分子機(jī)制仍未闡明。在課題組早期的工作中,黃仲曦副教授結(jié)合鼻咽癌細(xì)胞株的SNP芯片和表達(dá)譜芯片,在鼻咽癌的早期事件12p12-11擴(kuò)增區(qū)域中找到了在鼻咽癌細(xì)胞株中一致擴(kuò)增而相對(duì)于NP69一

2、致過(guò)表達(dá)的基因,即PTHLH。接著用熒光定量PCR對(duì)細(xì)胞株中PTHLH的拷貝數(shù)和表達(dá)進(jìn)行驗(yàn)證,實(shí)驗(yàn)結(jié)果與芯片結(jié)果大體一致。對(duì)17例鼻咽癌組織進(jìn)行RT-PCR,結(jié)果顯示PTHLH在64.7％的鼻咽癌組織中表達(dá)上調(diào)。免疫組化顯示PTHLH在83％的鼻咽癌組織中表達(dá)上調(diào)。基于這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果把PTHLH定為是一個(gè)候選的鼻咽癌瘤基因。因此,在本課題第一部分中,作者擬通過(guò)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證PTHLH在鼻咽癌細(xì)胞株中的致瘤能力。在本課題的第二步研究中

3、,擬通過(guò)鼻咽癌細(xì)胞株5-8F和6-10B來(lái)挖掘與鼻咽癌轉(zhuǎn)移特性密切相關(guān)的基因。
　　 鼻咽癌細(xì)胞株5-8F和6-10B均來(lái)自同一母細(xì)胞株SUNE-1,既往的研究已經(jīng)證實(shí),5-8F具有高成瘤、高轉(zhuǎn)移能力,而6-10B則只成瘤、不轉(zhuǎn)移。先前也已有一些基于這兩個(gè)細(xì)胞株的差異轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)等高通量研究報(bào)道。但是過(guò)去的高通量研究具有明顯的局限性,通常只檢測(cè)了人類大約25,000個(gè)基因中的不到8,000個(gè)?？紤]到過(guò)去高通量研究方法處理

4、量的局限性,我們擬通過(guò)全基因組微陣列技術(shù)來(lái)更加全面地研究5-8F和6-10B細(xì)胞株的生物學(xué)特性,挖掘出它們之間的差異表達(dá)基因和轉(zhuǎn)移相關(guān)基因并進(jìn)行初步分析。
　　 方法：
　　 1.靶基因PTHLH在鼻咽癌細(xì)胞株中的表達(dá)特性鑒定采用熒光定量PCR法和Western blot,分別從mRNA水平和蛋白水平檢測(cè)PTHLH在永生化鼻咽上皮細(xì)胞NP69和鼻咽癌細(xì)胞5-8F、6-10B、CNE1、CNE2、HONE1中的表達(dá)水平,初

5、步探討PTHLH在永生化鼻咽上皮細(xì)胞和鼻咽癌細(xì)胞中的表達(dá)差異,結(jié)合芯片數(shù)據(jù),找到高表達(dá)PTHLH的鼻咽癌細(xì)胞株作為下一步干擾對(duì)象。
　　 2.PTHLH表達(dá)沉默對(duì)鼻咽癌細(xì)胞生物學(xué)影響
　　 構(gòu)建靶基因PTHLH的慢病毒干擾、陰性對(duì)照載體,包裝成成熟的慢病毒顆粒感染高表達(dá)PTHLH的6-10B細(xì)胞,通過(guò)有限稀釋法,倒置熒光顯微鏡下挑取單克隆的方法篩選出穩(wěn)定的陽(yáng)性和空載克隆,熒光定量PCR檢測(cè)各干擾克隆細(xì)胞中PTHLH干擾效

6、率,篩選干擾效率最高的細(xì)胞克隆作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。MTT法、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期及平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PTHLH沉默后對(duì)細(xì)胞體外增殖的影響；Transwell檢測(cè)PTHLH沉默后細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)和侵襲能力的改變。
　　 3.鼻咽癌細(xì)胞株5-8F和6-10B差異表達(dá)基因的微陣列分析
　　 我們通過(guò)提供5-8F和6-10B細(xì)胞株的mRNA樣本,交由公司制作表達(dá)譜芯片,采用的是Affymetrix Human Geno

7、me U133 Plus 2.0微陣列(包含54,675個(gè)探針集,幾乎涵蓋了人類基因組的所有基因)通過(guò)三次生物學(xué)重復(fù)檢測(cè)這兩個(gè)細(xì)胞株。采用近期發(fā)表的兩個(gè)軟件來(lái)挖掘轉(zhuǎn)移相關(guān)基因及其分子機(jī)制。其一是GOEAST(Gene Ontology Enrichment.Analysis Software Toolkithttp://www.omicslab.genetics.ac.cn/GOEAST/),用來(lái)分析差異表達(dá)基因主要參與的生物學(xué)過(guò)程和分

8、子功能。其二是GenCLiP(http://www.genclip.com),通過(guò)挖掘文獻(xiàn)進(jìn)行基因聚類和構(gòu)建基因共發(fā)生網(wǎng)絡(luò),揭示差異表達(dá)基因參與的發(fā)病分子機(jī)理、基因網(wǎng)絡(luò)和調(diào)控通路。
　　 4.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
　　 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,熒光定量PCR法檢測(cè)鼻咽癌細(xì)胞株P(guān)THLH表達(dá)特性結(jié)果比較采用單因素方差分析,多重比較采用SNK檢驗(yàn)。第二章中熒光定量PCR、運(yùn)動(dòng)、侵襲實(shí)驗(yàn)、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞周

9、期采用單因素方差分析；MTT采用析因設(shè)計(jì)的方差分析；多重比較采用SNK檢驗(yàn)。
　　 結(jié)果：
　　 1.靶基因PTHLH在鼻咽癌細(xì)胞株中的表達(dá)特性鑒定
　　 1)熒光定量PCR法檢測(cè)PTHLH在永生化鼻咽上皮細(xì)胞NP69和鼻咽癌細(xì)胞5-8F、6-10B、CNE1、CNE2、HONE1表達(dá)水平,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=100.473,P=0.000),6-10B和HONE1表達(dá)最高。
　　 2)Western

10、blot檢測(cè)PTHLH在鼻咽癌細(xì)胞株5-8F、6-10B、CNE1、CNE2、HONE1中的蛋白表達(dá)水平,應(yīng)用Image-Pro Plus圖像分析軟件計(jì)算各條帶的光密度值,計(jì)算各細(xì)胞株的PTHLH表達(dá)率。結(jié)果顯示PTHLH在6-10B、HONE1中高表達(dá)。選擇6-10B作為干擾的靶細(xì)胞株進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。
　　 2.PTHLH表達(dá)沉默對(duì)鼻咽癌細(xì)胞生物學(xué)影響
　　 1)構(gòu)建慢病毒干擾載體和陰性對(duì)照載體,包裝慢病毒后感染6-10

11、B細(xì)胞,有限稀釋法于倒置熒光顯微鏡下挑取GFP+單克隆,熒光定量PCR檢測(cè)各克隆的PTHLH表達(dá)情況,篩選出干擾效率最高的克隆2(94.1％)為下一步實(shí)驗(yàn)的研究對(duì)象。陽(yáng)性克隆的干擾效率與6-10B和陰性對(duì)照細(xì)胞表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=59.833,P=0.000),同時(shí)檢測(cè)PTHLH在陰性對(duì)照中的表達(dá)相對(duì)于6-10B強(qiáng)度較一致(0.809±0.187)。陽(yáng)性干擾克隆命名為6-10B/PLVTHM-PTHLH,陰性對(duì)照克隆為6-10B/

12、PLVTHM。
　　 2)MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況,與陰性對(duì)照6-10B/PLVTHM和6-10B細(xì)胞相比,干擾克隆細(xì)胞6-10B/PLVTHM-PTHLH的增殖速度明顯減慢并且呈時(shí)間依賴關(guān)系,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=65526.028,P=0.000):流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明各組細(xì)胞中G1期、S期和G2/M期差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別為0.132、0.076、0.109)；平板克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示三組細(xì)胞的克隆形成率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=

13、118.940,P=0.000),6-10B/PLVTHM-PTHLH細(xì)胞克隆形成減少,6-10B和陰性對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.345)。綜合表明PTHLH表達(dá)干擾后,6-10B細(xì)胞體外生長(zhǎng)被抑制。
　　 3)Transwell小室檢測(cè)結(jié)果顯示,與6-10B和6-10B/PLVTHM細(xì)胞相比,6-10B/PINTHM-PTHLH細(xì)胞穿過(guò)聚碳酸酯膜的細(xì)胞數(shù)減少,差異具有顯著性(F=1966.153,P=0.000)。說(shuō)明P

14、THLH表達(dá)沉默降低了6-10B細(xì)胞的體外運(yùn)動(dòng)能力。
　　 4)用熒光定量PCR法檢測(cè)PTHLH沉默后細(xì)胞株中DKK1及b-catenin基因的表達(dá)水平的改變,結(jié)果顯示相對(duì)于6-10B及陰性對(duì)照細(xì)胞株,干擾后的細(xì)胞株DKK1及b-catenin的表達(dá)水平未出現(xiàn)明顯改變,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.104P=0903/F=0.210 P=0.816)。
　　 3.鼻咽癌細(xì)胞株5-8F和6-10B差異表達(dá)基因的微陣列分析

15、>　　 通過(guò)分析表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù),篩選出了60個(gè)差異表達(dá)基因,并在這60個(gè)基因中選取8個(gè)基因進(jìn)行了熒光定量PCR驗(yàn)證,實(shí)驗(yàn)結(jié)果與芯片結(jié)果具有高度的一致性,驗(yàn)證了芯片結(jié)果的可靠性。用在線軟件GOEAST對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)大部分差異表達(dá)基因參與了細(xì)胞和代謝過(guò)程,具有催化活性、離子結(jié)合能力和蛋白結(jié)合能力。將差異表達(dá)基因與所感興趣的關(guān)鍵詞進(jìn)行聚類分析,發(fā)現(xiàn)這些基因與凋亡、細(xì)胞周期、轉(zhuǎn)移、趨化因子和免疫編輯特異相關(guān)。以“轉(zhuǎn)移”
　

16、　 為關(guān)鍵詞構(gòu)建基因網(wǎng)絡(luò)圖,發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因中有42個(gè)為轉(zhuǎn)移相關(guān)基因(P<0.00001),其中11個(gè)基因形成了7個(gè)基因?qū)?P=0.013)。在轉(zhuǎn)移相關(guān)網(wǎng)絡(luò)圖中發(fā)現(xiàn)了在本課題中進(jìn)行驗(yàn)證的候選瘤基因PTHLH,和DKK1有著某種聯(lián)系。在研究PTHLH-DKK1-Wnt通路中,推測(cè)DKK1對(duì)Wnt通路的抑制作用可能是導(dǎo)致6-10B低轉(zhuǎn)移的因?yàn)?而實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)PTHLH對(duì)DKK1并沒(méi)有起到單獨(dú)的抑制作用。
　　 結(jié)論：
　　

17、 1.熒光定量PCR法和Western blot檢測(cè)PTHI_,H在鼻咽癌細(xì)胞5.8F、6.10B、CNE1、CNE2中的mRNA和蛋白水平的表達(dá)均有差異,6-10B和HONE1表達(dá)最高。選擇高成瘤細(xì)胞株6-10B為進(jìn)一步干擾對(duì)象。
　　 2.利用慢病毒載體和RN加技術(shù)建立了PTHLH表達(dá)穩(wěn)定下調(diào)的6-10B細(xì)胞株,干擾后細(xì)胞體內(nèi)、外生物學(xué)功能發(fā)生較明顯的改變。PTHLH表達(dá)下調(diào)抑制了6-10B細(xì)胞株的生長(zhǎng)和侵襲。說(shuō)明PTHLH

18、在6-10B細(xì)胞株的高成瘤中起到了一定的促進(jìn)作用。
　　 3.在不同轉(zhuǎn)移特性的細(xì)胞株5.8F和6.10B之間篩選出60個(gè)差異表達(dá)基因,參與細(xì)胞和代謝過(guò)程,與凋亡、細(xì)胞周期、轉(zhuǎn)移、趨化因子和免疫編輯特異相關(guān)。找出了42個(gè)轉(zhuǎn)移相關(guān)基因,構(gòu)建了轉(zhuǎn)移相關(guān)基因網(wǎng)絡(luò)圖。在研究PTHLH和DKK1-Wnt通路中,推測(cè)DKK1可能通過(guò)調(diào)節(jié)Wnt通路影響鼻咽癌的轉(zhuǎn)移。而DKK1的活性不單獨(dú)受PTHI,H的影響。PTHLH能夠促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞株6-1