EGFR表達(dá)和KRAS突變?cè)诒茄拾┰l(fā)灶和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶的差異以及Cetuximab聯(lián)合放化療對(duì)鼻咽癌細(xì)胞株作用機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、本論文的目的在于通過(guò)分別檢測(cè)鼻咽癌腫瘤組織EGFR蛋白表達(dá)以及鼻咽癌患者相配對(duì)的原發(fā)灶和頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶的EGFR蛋白表達(dá)和KRAS突變，探討鼻咽癌腫瘤組織EGRR蛋白表達(dá)與鼻咽癌患者生存預(yù)后的關(guān)系以及EGFR蛋白表達(dá)和KRAS突變?cè)诒茄拾┰l(fā)灶和頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶的差異及臨床意義；通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，了解EGFR靶向藥物Cetuximab聯(lián)合放療和順鉑對(duì)鼻咽癌細(xì)胞株的作用機(jī)制，探討Cetuximab聯(lián)合放化療治療鼻咽癌患者的臨床應(yīng)用前景和價(jià)

2、值。
　　 第一章 EGFR在鼻咽癌組織中的表達(dá)和臨床意義
　　 目的:
　　 采用免疫組化染色的方法檢測(cè)EGFR蛋白在鼻咽癌患者腫瘤組織中的表達(dá)，并分析其與鼻咽癌的臨床特征和生存預(yù)后的關(guān)系，為鼻咽癌的靶向治療提供初步依據(jù)。
　　 方法:
　　 本研究選取1999年1月至12月全年在中山大學(xué)腫瘤防治中心放療科治療的初治鼻咽癌病例，其中臨床和隨訪資料完整且能在我院病理科獲取鼻咽癌組織蠟塊標(biāo)本病例23

3、5例。所有患者均病理證實(shí)為未分化非角化性癌。用免疫組化方法檢測(cè)鼻咽癌組織中EGFR蛋白的表達(dá)情況，結(jié)合患者的臨床特征及隨訪資料，對(duì)患者的無(wú)瘤生存時(shí)間和總生存時(shí)間等進(jìn)行單因素Kaplan-Meier生存分析及多因素Cox回歸分析。結(jié)果采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和處理。
　　 結(jié)果:
　　 235例鼻咽癌患者組織中EGFR陽(yáng)性表達(dá)率為89.4％，陽(yáng)性表達(dá)部位主要在細(xì)胞膜。EGFR表達(dá)與T分期、N分期相關(guān)，而與年

4、齡、性別及臨床分期均無(wú)關(guān)。單因素Kaplan-Meier生存分析表明本組患者中EGFR表達(dá)高低不同者，其無(wú)復(fù)發(fā)生存時(shí)間、無(wú)轉(zhuǎn)移生存時(shí)間、無(wú)瘤生存時(shí)間和總生存時(shí)間的差別均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；多因素Cox回歸分析表明鼻咽癌組織EGFR高表達(dá)不是本組患者預(yù)后的獨(dú)立影響因素；
　　 結(jié)論:
　　 EGFR在鼻咽癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率高達(dá)89.4％，提示EGFR有可能作為鼻咽癌靶向治療的有效靶點(diǎn)。EGFR的表達(dá)與鼻咽癌的T分期、N分期相關(guān)，

5、而與年齡、性別和臨床分期無(wú)顯著相關(guān)，與預(yù)后無(wú)顯著相關(guān)。鼻咽癌組織EGFR高表達(dá)不是預(yù)后的獨(dú)立影響因素。
　　 第二章 EGFR表達(dá)和KRAS突變?cè)诒茄拾┰l(fā)灶和頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶的對(duì)比研究
　　 目的:
　　 通過(guò)分別比較EGFR蛋白表達(dá)和KRAS突變?cè)诒茄拾┗颊叩脑l(fā)灶和相應(yīng)頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中的情況，探討兩者在鼻咽原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶的差異，為臨床上靶向藥物治療鼻咽癌提供分子預(yù)測(cè)的初步依據(jù)。
　　 方法:

6、>　　 收集中山大學(xué)腫瘤防治中心1997年1月至2003年7月治療的86例初治并同時(shí)進(jìn)行鼻咽部和頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶活檢的鼻咽癌患者。分別檢測(cè)鼻咽原發(fā)灶和相應(yīng)頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶EGFR蛋白表達(dá)和KRAS突變情況，分別比較EGFR蛋白表達(dá)和KRAS突變?cè)诒茄试l(fā)灶和頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶的情況。雙邊P<0.05被認(rèn)為是有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS13.0分析數(shù)據(jù)。
　　 結(jié)果:
　　 86例配對(duì)的鼻咽癌原發(fā)灶和頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中

7、，EGFR的陽(yáng)性表達(dá)率分別為73.3％和60.5％，兩者之間的表達(dá)存在顯著性差異(p=0.001)；EGFR在原發(fā)灶和頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶之間總的變化率為29.1％。86例配對(duì)的鼻咽癌原發(fā)灶和頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中，共檢測(cè)了57例患者的KRAS突變情況，其中12例(21.1％)鼻咽癌原發(fā)灶存在KRAS突變，4例(7％)頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶存在KRAS突變，主要是第2外顯子13密碼子突變，4例患者的原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶同時(shí)存在KRAS突變。
　　

8、結(jié)論:
　　 鼻咽癌患者的原發(fā)灶和頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶均存在不同的EGFR蛋白表達(dá)和KRAS基因突變，為進(jìn)一步研究靶向藥物的臨床應(yīng)用篩選分子預(yù)測(cè)指標(biāo)提供依據(jù)。
　　 第三章 EGFR靶向藥物Cetuximab聯(lián)合照射和順鉑對(duì)鼻咽癌細(xì)胞株作用機(jī)制的體外實(shí)驗(yàn)研究
　　 目的:
　　 通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)，探討Cetuximab聯(lián)合照射和細(xì)胞毒藥物順鉑對(duì)鼻咽癌的作用機(jī)制和臨床價(jià)值。
　　 方法:
　　 選擇人

9、鼻咽癌細(xì)胞株CNE2，MTT法測(cè)定Cetuximab、順鉑以及兩藥聯(lián)合的細(xì)胞毒作用；采用Annexin V-FITC and Propidium Iodide(PI)雙染法通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)Cetuximab聯(lián)合照射和順鉑處理后的早期細(xì)胞調(diào)亡和細(xì)胞周期情況；提取用Cetuximab聯(lián)合照射和順鉑處理后的細(xì)胞總蛋白，用免疫印跡的方法分析PI3K/Akt信號(hào)通路的關(guān)鍵酶Akt、p-Akt(Ser473)，MEK/MAPK信號(hào)通路的關(guān)鍵酶ER

10、K1/2、p-ERK1/2蛋白以及凋亡死亡底物PRAP的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果:
　　 Cetuximab對(duì)鼻咽癌細(xì)胞株CNE2的生長(zhǎng)有一定的抑制作用。Cetuximab聯(lián)合順鉑作用后，抑制鼻咽癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用增強(qiáng)。Western blot分析結(jié)果示，照射、細(xì)胞毒藥物順鉑對(duì)EGFR、AKT、ERK1/2、p-AKT和p-ERK1/2蛋白水平影響不明顯，Cetuximab無(wú)論單用或聯(lián)合順鉑和或照射應(yīng)用對(duì)CNE2細(xì)胞株的p-

11、EGFR、p-AKT、p-ERK1/2蛋白水平均有下調(diào)作用，而對(duì)EGFR、AKT和ERK1/2的總量影響不大。與單用Cetuximab相比，Cetuximab聯(lián)合照射或順鉑可以進(jìn)一步下調(diào)p-EGFR、p-AKT和p-ERK1/2蛋白的表達(dá)，以作用48h后更明顯。而Cetuximab聯(lián)合照射和順鉑幾乎完全抑制p-EGFR、p-AKT和p-ERK1/2的表達(dá)。
　　 結(jié)論:
　　 單藥Cetuximab在體外對(duì)CNE2細(xì)胞株

12、的增殖都具有一定的抑制作用，聯(lián)合順鉑抑制作用增強(qiáng)顯。單藥Cetuximab能誘導(dǎo)CNE2細(xì)胞發(fā)生凋亡，聯(lián)合照射和細(xì)胞毒藥順鉑作用，誘導(dǎo)CNE2細(xì)胞株細(xì)胞凋亡的作用更強(qiáng)。Cetuximab可抑制胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)的AKT及ERK通路，Cetuximab聯(lián)合照射和順鉑可導(dǎo)致胞內(nèi)相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)通路產(chǎn)生更明顯抑制。
　　 第四章 Cetuximab聯(lián)合照射和順鉑對(duì)人鼻咽癌移植瘤荷瘤裸鼠模型作用的研究
　　 目的:
　　 觀察

13、Cetuximab單用和或聯(lián)合照射及順鉑對(duì)鼻咽癌荷瘤裸鼠移植瘤生長(zhǎng)有無(wú)抑制作用，以及裸鼠對(duì)Cetuximab聯(lián)合照射和或順鉑的耐受性，探討Cetuximab聯(lián)合照射和細(xì)胞毒藥物順鉑在體內(nèi)對(duì)鼻咽癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響和治療價(jià)值，為臨床研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法:
　　 用CNE2細(xì)胞在裸鼠身上建立鼻咽癌移植瘤模型，移植瘤荷瘤裸鼠總共80只，隨機(jī)分為8組，分別為對(duì)照組、單純照射組，單藥Cetuximab治療組，Cetuxima

14、b聯(lián)合照射治療組，單藥DDP治療組，DDP聯(lián)合照射組，Cetuximab聯(lián)合DDP治療組，Cetuximab聯(lián)合照射和DDP治療組，每組各10只。Cetuximab治療組每間隔3天用含Cetuximab1 mg的藥物原液0.5ml，腹腔內(nèi)注射，總共給藥3次，第一次給藥在放療和DDP注射前6小時(shí)給藥；DDP治療組每次用含5mg/kg DDP腹腔內(nèi)注射，隔天給藥，連續(xù)給藥3次。照射組每天照射2Gy，連續(xù)照射6天。期間每周2次用毫米游標(biāo)卡尺測(cè)

15、量裸鼠腫瘤的長(zhǎng)、寬最大垂直直徑的大小，記錄并計(jì)算各組裸鼠治療前體重和腫瘤體積，治療后的平均體重和腫瘤體積。結(jié)束用藥和照射后觀察3周后處死動(dòng)物，取出腫瘤組織，把移植瘤用石蠟包埋以便免疫組化分析。
　　 結(jié)果:
　　 治療前各組裸鼠體重和腫瘤體積均無(wú)顯著性差異；治療過(guò)程中未觀察到明顯的裸鼠進(jìn)食、活動(dòng)減少和皮疹等不良反應(yīng)；治療后各組裸鼠腫瘤體積和重量均較對(duì)照組減少，腫瘤生長(zhǎng)受到一定的抑制，Cetuximab聯(lián)合照射和順鉑，能更

16、明顯抑制腫瘤的生長(zhǎng)，與對(duì)照組裸鼠相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 結(jié)論:
　　 CNE2鼻咽癌細(xì)胞荷瘤裸鼠對(duì)Cetuximab聯(lián)合放療和細(xì)胞毒藥物順鉑治療的耐受性較好；Cetuximab聯(lián)合照射或順鉑對(duì)CNE2細(xì)胞裸鼠移植瘤模型具有一定的抑制作用，三者聯(lián)合能明顯抑制腫瘤生長(zhǎng)，但Cetuximab與DDP和/或照射合用未能顯著增強(qiáng)DDP和/或照射聯(lián)合對(duì)CNE2細(xì)胞裸鼠移植瘤模型的效果。
　　 結(jié)論:
　　 1.E

17、GFR在鼻咽癌組織中高表達(dá)，與T分期和N分期相關(guān)，而與年齡、性別和臨床分期無(wú)關(guān)。
　　 2.EGFR的表達(dá)與鼻咽癌的預(yù)后無(wú)明顯相關(guān)，EGFR高表達(dá)不是鼻咽癌預(yù)后的獨(dú)立影響因素。
　　 3.EGFR蛋白表達(dá)和KRAS突變鼻咽癌原發(fā)病灶和轉(zhuǎn)移病灶之間存在差異。鼻咽癌KRAS突變主要是第2外顯子13號(hào)密碼子。
　　 4.Cetuximab單藥能抑制CNE2的增殖，但抑制作用并不明顯，聯(lián)合順鉑作用，其抑制強(qiáng)度增加，具有協(xié)

18、同效應(yīng)。
　　 5.Cetuximab可誘導(dǎo)CNE2細(xì)胞凋亡，聯(lián)合照射和順鉑，其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用更明顯。
　　 6.Cetuximab可抑制p-EGFR的活化而導(dǎo)致胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)AKT及ERK通路的抑制，聯(lián)合照射和順鉑作用，其抑制通路分子的作用更明顯。
　　 7.CNE2細(xì)胞荷瘤裸鼠對(duì)Cetuximab聯(lián)合照射和順鉑治療的耐受性較好。
　　 8.Cetuximab聯(lián)合照射或順鉑對(duì)CNE2細(xì)胞裸鼠移植瘤模型