川芎嗪、丹參酮ⅡA對PG干細胞樣細胞惡性生物學(xué)行為影響的研究.pdf

1、立題依據(jù)：
　　肺癌是國內(nèi)外死亡率和發(fā)病率最高的惡性腫瘤類疾病，盡管針對肺癌的診斷手段和治療方法不斷革新，其遠期生存期仍令人擔(dān)憂，轉(zhuǎn)移、耐藥及療后復(fù)發(fā)是導(dǎo)致其預(yù)后差的主要因素。腫瘤干細胞(cancer stem cells，CSCs)理論的提出為腫瘤的發(fā)生、發(fā)展機制揭示了新的視角，為腫瘤的治療帶來了新的希望，CSCs被認(rèn)為是具有異質(zhì)性的腫瘤組織中的含量極少的細胞亞群，在腫瘤的發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移及耐藥等諸多方面都體現(xiàn)出強于已分化腫瘤細

2、胞的惡性生物學(xué)特性，分選、鑒別并靶向殺傷CSCs是當(dāng)前腫瘤學(xué)領(lǐng)域研究的熱點。通過患者的臨床癥狀、血液流變學(xué)異常、微循環(huán)障礙等表現(xiàn)，可以判斷血瘀證是包括肺癌患者在內(nèi)的惡性腫瘤患者證候群中的重要證素，血瘀證不僅是肺癌等患者常見的客觀征象，也對惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移產(chǎn)生協(xié)同促進作用。活血藥是肺癌臨床治療處方中的重要構(gòu)成部分，活血藥不僅有效地改善患病機體血行狀況、緩解臨床癥狀，還對腫瘤細胞的增殖、周期、侵襲、轉(zhuǎn)移等產(chǎn)生一定的影響。在前期研究中，我

3、們已經(jīng)證實了川芎、蘇木、雞血藤、水蛭等活血藥對lewis肺癌的轉(zhuǎn)移有一定的抑制作用，其抑制作用機理可能與影響CD44V6、p-選擇素、CD29、E-Cad、HIF-1α等蛋白表達有關(guān)，同時，我們也發(fā)現(xiàn)蘇木、雞血藤等活血藥可對肺癌細胞的增殖有一定的抑制作用，其抑制作用與細胞周期阻滯及促進凋亡有關(guān)。本研究即是在前期研究的基礎(chǔ)上，結(jié)合現(xiàn)在備受關(guān)注的CSCs理論，觀察前期研究所用活血藥川芎、丹參的有效成分川芎嗪和丹參酮ⅡA對肺癌干細胞樣細胞的增

4、殖、凋亡、粘附、侵襲、耐藥及血管生成等惡性生物學(xué)行為的影響，以期從影響肺癌干細胞的角度探索活血藥的作用機理和可能的作用靶點，為完善肺癌的血瘀證理論及臨床合理應(yīng)用活血藥提供科學(xué)依據(jù)。
　　研究目的：
　　1、分選并鑒定高轉(zhuǎn)移性人肺巨細胞癌PG（分為高轉(zhuǎn)移亞系PG-BE1、低轉(zhuǎn)移亞系PG-LH7）中的干細胞樣細胞，并探索PG原代細胞及不同氧濃度下干細胞樣細胞在粘附、侵襲、耐藥、血管生成等方面的差異;
　　2、研究活血藥川芎

5、、丹參的有效成分川芎嗪及丹參酮ⅡA對PG干細胞樣細胞增殖、凋亡、粘附、侵襲、血管生成、耐藥等的影響。
　　研究方法：
　　1、采用無血清成球培養(yǎng)法分選PG-BE1、PG-LH7細胞系中的干細胞樣細胞亞群，并采用平板克隆形成實驗、細胞凋亡檢測、細胞周期檢測及干細胞相關(guān)標(biāo)志(CD133、SOX-2、OCT-4、Nanog)檢測等驗證其干性;
　　2、采用MTT實驗觀察不同濃度梯度川芎嗪、丹參酮ⅡA在24h、48h、72h等

6、不同時間點上對PG-BE1、PG-LH7干細胞樣細胞增殖的影響;
　　3、采用人造基底膜粘附實驗檢測不同氧濃度下PG-BE1和PG-LH7干細胞樣細胞、PG-BE1和PG-LH7原代細胞、活血藥干預(yù)后PG-BE1和PG-LH7干細胞樣細胞的粘附能力，采用免疫熒光染色法檢測上述各組細胞CD29、CD44V6蛋白的表達，采用Western blot法檢測各組細胞CD29、CD44V6蛋白的表達量;
　　4、采用Transwell

7、小室侵襲實驗檢測不同氧濃度下PG-BE1和PG-LH7干細胞樣細胞、PG-BE1和PG-LH7原代細胞、活血藥干預(yù)后PG-BE1和PG-LH7干細胞樣細胞的侵襲能力，采用免疫熒光染色法檢測上述各組細胞E-Cad、N-Cad、Vimentin、MMP-2等蛋白的表達，采用Western blot法檢測各組細胞E-Cad、N-Cad、Vimentin、MMP-2等蛋白的表達量;
　　5、采用ELISA實驗檢測不同氧濃度下PG-BE1和

8、PG-LH7干細胞樣細胞、PG-BE1和PG-LH7原代細胞、活血藥干預(yù)后PG-BE1和PG-LH7干細胞樣細胞的VEGF的表達，采用Western blot法檢測各組細胞HIF-1α蛋白的表達量，采用RT-PCR實驗檢測各組細胞VEGF、HIF-1α mRNA的表達;
　　6、采用MTT實驗檢測PG-BE1、PG-LH7干細胞樣細胞對常用化療藥順鉑、吉西他濱及紫杉醇的耐受能力，采用Western blot法檢測不同氧濃度下PG-

9、BE1和PG-LH7干細胞樣細胞、PG-BE1和PG-LH7原代細胞、活血藥干預(yù)后PG-BE1和PG-LH7干細胞樣細胞的耐藥相關(guān)蛋白ABCG2的表達，采用RT-PCR實驗檢測各組細胞ABCG2 mRNA的表達。
　　研究結(jié)果：
　　1、采用無血清成球培養(yǎng)法培養(yǎng)的PG-BE1及PG-LH7細胞在培養(yǎng)至第4天開始出現(xiàn)較規(guī)則的球體，培養(yǎng)至第6天球體表面顏色變暗、折光性降低;平板克隆形成實驗結(jié)果顯示PG-BE1成球細胞與原代細胞的

10、克隆灶形成數(shù)目分別為(8.06±1.31)個、(3.94±1.06)個，兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.001)。PG-LH7成球細胞與原代細胞的克隆灶形成數(shù)目分別為(6.06±1.35)個、(2.67±1.33)個，兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.001);PG-BE1成球細胞與原代細胞CD133表達分別為(7.158±4.209)％、(0.838±0.649)％，兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p=0.028)。PG-LH7成球細胞與原代細胞CD

11、133表達分別為(3.785±2.968)％、(0.653±0.311)％，兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p=0.081);PG-BE1成球細胞與原代細胞G0/G1期細胞比例分別為(84.04±5.27)％、(50.57±1.78)％，兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.001)。PG-LH7成球細胞與原代細胞G0/G1期細胞比例分別為(54.06±2.51)％、(55.71±1.29)％，兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p=0.366); PG-BE1成球細

12、胞的早期凋亡率、中晚期凋亡率及總凋亡率均低于原代細胞，p值分別為:0.021、0.001、＜0.001。PG-LH7成球細胞的早期凋亡率、中晚期凋亡率及總凋亡率亦低于原代細胞，p值均為0.002; PG-BE1成球細胞表面干細胞表面標(biāo)志SOX-2、OCT-4及Nanog的表達強于其親代細胞，p值分別為0.017、0.01、0.029; PG-LH7成球細胞表面干細胞表面標(biāo)志SOX-2、OCT-4及Nanog的表達亦強于其親代細胞，p值分

13、別為0.001、0.032、0.044。
　　2、川芎嗪作用PG-BE1干細胞樣細胞24h、48h后，隨藥物濃度增加而抑制作用增強，當(dāng)川芎嗪濃度達到300μ g/ml后，抑制作用增強不明顯。不同濃度的川芎嗪的抑制增殖作用均有時效關(guān)系;川芎嗪對PG-LH7干細胞樣細胞的抑制作用在不同時間上均存在量效關(guān)系。10μ g/ml、50μ g/ml濃度川芎嗪在48h時作用最強，100μ g/ml、300μ g/ml、500μ g/ml濃度組隨

14、時間延長，抑制作用增強;丹參酮ⅡA對PG-BE1干細胞樣細胞的增殖抑制作用存在量效關(guān)系。濃度為0.25μ g/ml、0.50μ g/ml的丹參酮ⅡA隨作用時間延長而有更強的抑制增殖能力;0.75μ g/ml、1.00μ g/ml、1.25μ g/ml的丹參酮ⅡA在作用時間為48h時抑制作用最強;丹參酮ⅡA對PG-LH7干細胞樣細胞的增殖抑制作用存在量效和實效關(guān)系。
　　3、PG-BE1及PG-LH7干細胞樣細胞的粘附能力均強于其原

15、代細胞，其p值分別為0.013、0.005; PG-BE1及PG-LH7干細胞樣細胞在不同氧濃度環(huán)境下的粘附能力均無差異，其p值分別為0.74、0.151;不同濃度川芎嗪及丹參酮ⅡA均可抑制PG-BE1干細胞樣細胞的粘附能力，且不同濃度川芎嗪的抑制作用呈現(xiàn)劑量依賴性，中、高濃度丹參酮ⅡA的抑制作用強于低濃度，中、高濃度之間抑制作用無差異(p=0.588);不同濃度川芎嗪及丹參酮ⅡA均可抑制PG-LH7干細胞樣細胞的粘附能力，不同濃度川芎

16、嗪的抑制作用無差異，中、低劑量丹參酮ⅡA的抑制作用弱于高劑量，中、低劑量之間抑制作用無差異(p=0.585)。PG-BE1干細胞樣細胞的CD29及CD44V6表達均強于其原代細胞(p＜0.001); PG-BE1干細胞樣細胞在不同氧濃度下的CD29表達無差異(p=0.188)，PG-BE1干細胞樣細胞在常氧環(huán)境下CD44V6的表達量高于低氧環(huán)境(p＜0.001); PG-LH7干細胞樣細胞的CD44V6表達量高于原代細胞(p=0.028

17、)，CD29的表達與原代細胞無差異(p=0.302); PG-LH7干細胞樣細胞在常氧環(huán)境下CD29的表達量高于低氧環(huán)境(p=0.004)，而CD44V6在不同氧環(huán)境下表達無差異(p=0.071);不同濃度的川芎嗪及丹參酮ⅡA均可抑制PG-BE1干細胞樣細胞CD29的表達，川芎嗪及丹參酮ⅡA的抑制作用均無劑量依賴性;高濃度川芎嗪及不同濃度丹參酮Ⅱ A可抑制PG-BE1干細胞樣細胞CD44V6的表達，丹參酮ⅡA的抑制作用存在劑量依賴性;不

18、同劑量川芎嗪及丹參酮ⅡA對PG-LH7干細胞樣細胞CD29的表達均無抑制作用。但可抑制CD44V6的表達，不同濃度之間的抑制作用無劑量相關(guān)性。
　　4、PG-BE1及PG-LH7干細胞樣細胞的侵襲能力均強于其原代細胞(p＜0.001)，低氧環(huán)境中的PG-BE1干細胞樣細胞侵襲能力強于常氧環(huán)境(p=0.038)，PG-LH7干細胞樣細胞在不同氧環(huán)境下侵襲能力無差異(p=0.406);PG-BE1干細胞樣細胞E-Cad、N-Cad表達

19、強于原代細胞（其p值分別為0.003、＜0.001），PG-LH7干細胞樣細胞Vimentin的表達強于原代細胞（p值為0.032）;低氧環(huán)境下，PG-BE1干細胞樣細胞的E-Cad表達下調(diào)(p＜0.001)，N-Cad、Vimentin、MMP-2的表達上調(diào)（p值均小于0.05）。PG-LH7干細胞樣細胞N-Cad、Vimentin、MMP-2的表達均上調(diào)（p值均小于0.05）;
　　不同濃度川芎嗪及丹參酮ⅡA均可抑制PG-BE

20、1干細胞樣細胞的侵襲能力（各組與空白組相比，p值均小于0.05），不同濃度川芎嗪的抑制作用有劑量依賴性，中、低濃度丹參酮ⅡA的抑制作用弱于高濃度，低、中濃度之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p=0.349);不同濃度川芎嗪及丹參酮ⅡA均可抑制PG-LH7干細胞樣細胞的侵襲能力，川芎嗪及丹參酮ⅡA的抑制作用均無劑量依賴性。川芎嗪及丹參酮ⅡA對兩種干細胞樣細胞侵襲能力的影響與對E-Cad、N-Cad、Vimentin、MMP-2等蛋白的表達有關(guān)。<

21、br>　　5、PG-BE1、PG-LH7干細胞樣細胞VEGF表達均顯著強于原代細胞(p＜0.001)，低氧環(huán)境下PG-BE1、PG-BE1干細胞樣細胞VEGF表達均顯著強于常氧環(huán)境(p＜0.001)。不同濃度川芎嗪與丹參酮ⅡA均對PG-BE1、PG-LH7干細胞樣細胞的VEGF表達均有一定的抑制作用，且抑制作用有劑量相關(guān)性。
　　PG-BE1、PG-LH7干細胞樣細胞的HIF-1α的表達均強于其原代細胞(p＜0.05)，PG-BE

22、1干細胞樣細胞在低氧環(huán)境下的HIF-1α的表達強于常氧環(huán)境(p＜0.05)，PG-LH7干細胞樣細胞在低氧環(huán)境下的HIF-1α的表達與常氧環(huán)境表達無差異(p=1.0);不同濃度川芎嗪及丹參酮ⅡA均可對PG-BE1干細胞樣細胞HIF-1α的表達產(chǎn)生抑制作用(p＜0.05)，不同濃度川芎嗪之間，抑制作用無差異(p＞0.05)，低、中濃度丹參酮ⅡA的抑制作用強于高濃度。不同濃度川芎嗪對PG-LH7干細胞樣細胞HIF-1α的表達均無明顯抑制作用

23、。不同濃度丹參酮ⅡA均可對PG-LH7干細胞樣細胞HIF-1α的表達產(chǎn)生抑制作用，高濃度丹參酮ⅡA的抑制強度強于低、中濃度組。川芎嗪及丹參酮ⅡA對兩種細胞VEGF、HIF-1α表的抑制與其下調(diào)其mRNA表達相關(guān)。
　　6、MTT結(jié)果顯示，PG-BE1、PG-LH7干細胞樣細胞對順鉑、吉西他濱、紫杉醇的耐受性普遍強于其原代細胞。PG-BE1、PG-LH7干細胞樣細胞的化療耐藥性可能與其高表達ABCG-2有關(guān)（與原代細胞相比，p＜0.

24、001），此外，兩種細胞在常氧環(huán)境中ABCG-2蛋白的表達量高于低氧環(huán)境(p＜0.001);川芎嗪與丹參酮ⅡA均可抑制ABCG-2蛋白表達，不同濃度抑制作用無劑量依賴性。除低劑量丹參酮ⅡA組外，各劑量川芎嗪及丹參酮ⅡA對PG-LH7干細胞樣細胞ABCG-2蛋白的表達均有一定的抑制作用，不同濃度抑制作用亦無劑量依賴性。川芎嗪及丹參酮ⅡA對兩種細胞ABCG-2表達的抑制與其下調(diào)其mRNA表達相關(guān)。
　　研究結(jié)論：
　　1、采用無

25、血清成球培養(yǎng)法可一定程度上分選肺癌細胞系中的CSCs亞群，可通過對其自我更新、細胞凋亡、細胞周期、表面標(biāo)志等的檢測驗證其干性。
　　2、川芎嗪和丹參酮ⅡA均可抑制PG-BE1、PG-LH7干細胞樣細胞增殖，川芎嗪抑制作用較弱，兩者的抑制作用有一定的量效、時效關(guān)系。
　　3、PG-BE1、PG-LH7干細胞樣細胞有較其原代細胞更強的人造基底膜粘附能力，川芎嗪和丹參酮ⅡA可抑制其粘附作用，其抑制作用與影響CD29及CD44V6蛋

26、白的表達有關(guān)。
　　4、PG-BE1、PG-LH7干細胞樣細胞有較其原代細胞更強的侵襲能力，且其侵襲能力在低氧環(huán)境中更明顯，川芎嗪和丹參酮ⅡA可一定程度上抑制其侵襲能力，其抑制作用與影響E-Cad、N-Cad、Vimentin、MMP-2等蛋白的表達有關(guān)。
　　5、PG-BE1、PG-LH7干細胞樣細胞可能具有更強的促血管生成能力，川芎嗪和丹參酮ⅡA可通過抑制其HIF-1α及VEGF的表達而抑制其血管生成能力。
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