FKBP25及其缺失突變體與CLIC1相互作用的研究.pdf

1、目的:為進(jìn)一步了解哺乳動(dòng)物細(xì)胞中FKBP25蛋白的生物學(xué)功能,構(gòu)建下游帶FLAG標(biāo)簽的FKBP25缺失突變體FKBP25-FLAG-N和FKBP25-FLAG-C真核表達(dá)質(zhì)粒。分別將FKBP25及兩個(gè)缺失突變體表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至COS7細(xì)胞中,觀察各組蛋白單獨(dú)表達(dá)時(shí)在細(xì)胞內(nèi)的定位情況;分別將帶不同標(biāo)簽的FKBP25與CLIC1表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至COS7細(xì)胞和HEK293T細(xì)胞中,通過免疫熒光方法觀察各組蛋白在細(xì)胞內(nèi)的共定位情況;免疫共沉淀方法

2、檢測各組蛋白在細(xì)胞內(nèi)的相互作用情況。
　　方法:以pCDNA3.1-FKBP25-FLAG重組質(zhì)粒為模板,用PCR方法構(gòu)建pCDNA3.1-FKBP25-FLAG-N和pCDNA3.1-FKBP25-FLAG-C真核表達(dá)質(zhì)粒。重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切鑒定正確后送去測序。采用脂質(zhì)體法進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染,將帶不同標(biāo)簽的FKBP25和CLIC1質(zhì)粒單獨(dú)轉(zhuǎn)染至COS7細(xì)胞中,利用細(xì)胞免疫熒光技術(shù)研究各組蛋白單轉(zhuǎn)定位變化;將pCDNA3.1-FKBP25

3、-FLAG及兩個(gè)缺失突變體、pCDGFP-FKBP25質(zhì)粒分別與帶不同標(biāo)簽CLIC1質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至COS7細(xì)胞中,在熒光顯微鏡下觀察各組蛋白在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)共定位情況;分別將pCDGFP-FKBP25、pCDNA3.1-FKBP25-FLAG兩個(gè)缺失突變體質(zhì)粒和帶不同標(biāo)簽的CLIC1質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞中,通過免疫共沉淀方法檢測FKBP25及兩個(gè)缺失突變體蛋白與CLIC1蛋白在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的是否相互作用。
　　結(jié)果:經(jīng)酶

4、切和測序結(jié)果鑒定,重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。免疫熒光顯微鏡觀察 FKBP25蛋白主要分布在細(xì)胞質(zhì),細(xì)胞核也有一定分布;兩個(gè)缺失突變體蛋白的定位沒有變化。CLIC1蛋白主要分布在細(xì)胞核,核膜處也有分布,細(xì)胞質(zhì)內(nèi)次之。共定位觀察FKBP25及兩個(gè)缺失突變體蛋白與CLIC1蛋白在COS7細(xì)胞中主要分布在細(xì)胞質(zhì),核膜及細(xì)胞核內(nèi)少量分布。免疫共沉淀檢測 FKBP25及pCDNA3.1-FKBP25-FLAG-N蛋白和CLIC1蛋白在HEK293T細(xì)胞中存