肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞STIM1-Orai1相互作用初步研究.pdf

1、目的：
　　研究STIM1、Orai1蛋白在原代培養(yǎng)的正常大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（Pulmonary artery smooth muscle cells，PASMCs）上的表達(dá)和相互作用關(guān)系，為肺動(dòng)脈高壓研究提供基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：
　　利用PCR技術(shù)獲得STIM1、Orai1基因，分別與載體pLV-c-flag、pLV-c-HA連接，構(gòu)建慢病毒載體pLV-c-flag-STIM1、pLV-c-HA-Orai1；

2、將慢病毒載體pLV-c-flag-STIM1、pLV-c-HA-Orai1感染大鼠PASMCs，Western-blot檢測(cè)感染前后STIM1、Orai1蛋白表達(dá)；鈣熒光測(cè)定大鼠PASMCs，觀察鈣池操縱性Ca2+內(nèi)流；利用免疫熒光結(jié)合激光共聚焦技術(shù)對(duì)flag、HA標(biāo)簽蛋白進(jìn)行共定位，觀察經(jīng)Ca2+釋放激動(dòng)劑（CPA）處理前后STIM1、Orai1蛋白位置變化；分別用STIM1、Orai1抗體進(jìn)行免疫共沉淀，觀察大鼠PASMCs中STI

3、M1、Orai1兩種蛋白的相互作用關(guān)系。
　　結(jié)果：
　　重組載體pLV-c-flag-STIM1、pLV-c-HA-Orai1經(jīng)雙酶切、測(cè)序鑒定正確；將慢病毒載體 pLV-c-flag-STIM1、pLV-c-HA-Orai1感染原代培養(yǎng)大鼠PASMCs，Western-blot檢測(cè)STIM1、Orai1蛋白表達(dá)量明顯增高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；免疫熒光對(duì)標(biāo)簽蛋白flag、HA進(jìn)行共定位，激光共聚焦顯微鏡觀察到STIM1存在于胞