肌營養(yǎng)不良蛋白聚糖DG與Sedlin蛋白的相互作用.pdf

1、目的：本研究旨在證明肌營養(yǎng)不良蛋白聚糖DG是否與Sedlin蛋白之間存在相互作用，以及進(jìn)一步探尋DG中與Sedlin存在相互作用的具體結(jié)構(gòu)域。并依次應(yīng)用了質(zhì)粒構(gòu)建、酵母雙雜交、免疫印跡、GST Pulldown、間接免疫熒光以及免疫共沉淀等實(shí)驗(yàn)技術(shù)，分別從酵母細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞以及體外三個(gè)層面對(duì)此加以證實(shí)，為探索DG蛋白和Sedlin蛋白的功能奠定一定的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。
　　方法：在酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)中，我們依次構(gòu)建DG的酵母表達(dá)質(zhì)粒pG

2、ΑDT7-DAG1，pGBKT7-DΑG1，并分別與本實(shí)驗(yàn)室保存的Sedlin的酵母表達(dá)質(zhì)粒pGBKT7-SEDL，pGΑDT7-SEDL共同轉(zhuǎn)化至酵母細(xì)胞（ΑH109）中，然后在SD3-(-Leu/-His/-Trp)培養(yǎng)基上進(jìn)行營養(yǎng)篩選，并對(duì)生長出的克隆進(jìn)行α-半乳糖苷酶（X-α-gαl）活性測(cè)定，通過觀察克隆是否變藍(lán)來證明 DG是否與 Sedlin存在相互作用。然后我們繼續(xù)構(gòu)建pcDNΑ3.1-DΑG1-FLΑG真核表達(dá)質(zhì)粒。在G

3、ST Pulldown實(shí)驗(yàn)中，將pcDNΑ3.1-DΑG1-FLΑG單獨(dú)轉(zhuǎn)染到哺乳動(dòng)物細(xì)胞（HEK293T），然后提取細(xì)胞總蛋白，與本實(shí)驗(yàn)室保存的GST-Sedlin融合蛋白在體外混懸，收集谷胱甘肽珠子進(jìn)行免疫印跡分析證明DG是否與Sedlin存在相互作用。在間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)中，將pcDNΑ3.1-DΑG-FLΑG和pcDGFP-SEDL共同轉(zhuǎn)染到哺乳動(dòng)物細(xì)胞中（COS7），進(jìn)行免疫熒光制片，通過熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察DG是否

4、與Sedlin存在共定位現(xiàn)象。在免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)中，將pcDNΑ3.1-DΑG1-FLΑG和pcDGFP-SEDL共同轉(zhuǎn)染到哺乳動(dòng)物細(xì)胞中（HEK293T），提取細(xì)胞總蛋白，利用FLAG抗體孵育和瓊脂糖珠沉淀后，收集珠子進(jìn)行免疫印跡分析證明DG是否與Sedlin存在相互作用。接下來，我們又利用了上述同樣的實(shí)驗(yàn)方法，進(jìn)一步研究了 DG的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域（α-DG和β-DG）與Sedlin之間的相互作用情況。
　　結(jié)果：酶切鑒定結(jié)果和測(cè)序結(jié)果

5、一致證明所需質(zhì)粒構(gòu)建成功。酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)顯示，共同表達(dá)了DG和Sedlin兩種蛋白的酵母細(xì)胞在SD3-培養(yǎng)基中能夠正常生長，且克隆在進(jìn)行α-半乳糖苷酶（X-α-gαl）活性測(cè)定后顏色變藍(lán)，即證明二者存在相互作用。GST Pulldown實(shí)驗(yàn)顯示，當(dāng)用FLAG抗體免疫印跡后，實(shí)驗(yàn)組（GST-Sedlin+DG-FLΑG）能夠檢測(cè)到DG的存在，表明GST-Sedlin融合蛋白在體外條件下能夠下拉 DG蛋白，則證明二者存在相互作用。間接免疫熒

6、光實(shí)驗(yàn)顯示，DG在COS7細(xì)胞主要分布在細(xì)胞質(zhì)中，而Sedlin在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中都有分布，且二者在細(xì)胞質(zhì)中存在明顯的共定位現(xiàn)象。免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)顯示，當(dāng)用GFP抗體免疫印跡后，實(shí)驗(yàn)組（Sedlin-GFP+DG-FLΑG）中能夠檢測(cè)到Sedlin-GFP的存在，表明FLAG抗體在沉淀DG-FLΑG的同時(shí)也將Sedlin-GFP共同沉淀下來，即證明二者存在相互作用。在進(jìn)一步的研究中，GST-Sedlin融合蛋白在體外條件下也能下拉α-DG

7、和β-DG蛋白；且α-DG和β-DG與Sedlin在COS7的細(xì)胞質(zhì)中也都存在共定位現(xiàn)象；且FLAG抗體在沉淀α-DG和β-DG的同時(shí)也能將Sedlin共沉淀下來，這一致表明α-DG和β-DG都與Sedlin存在相互作用。
　　結(jié)論：通過酵母雙雜交、GST下拉技術(shù)、間接免疫熒光、免疫共沉淀等四種技術(shù)充分證實(shí)了肌營養(yǎng)不良蛋白聚糖DG和Sedlin蛋白在酵母細(xì)胞中、哺乳動(dòng)物細(xì)胞中以及體外實(shí)驗(yàn)中都存在相互作用，且DG的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，即α-