肌營(yíng)養(yǎng)不良與Miyoshi肌病中dysferlin表達(dá)分析.pdf

1、目的： 肢帶型肌營(yíng)養(yǎng)不良(limb girdle muscular dystrophy，LGMD)為一組高度遺傳異質(zhì)性疾病，臨床上病變主要累及上、下肢帶肌，或以肢帶肌首先受累，逐漸出現(xiàn)全身肌肉的無(wú)力和萎縮?，F(xiàn)在根據(jù)遺傳學(xué)特點(diǎn)把這一組疾病分為常染色體顯性肢帶型肌營(yíng)養(yǎng)不良(LGMD1)和常染色體隱性肢帶型肌營(yíng)養(yǎng)不良(LGMD2)兩大類，根據(jù)受累基因的不同LGMD1分為L(zhǎng)GMDlA～LGMD1G七種類型，LGMD2又分為L(zhǎng)GMD2A～

2、LGMD2L十二種類型(表格1，Neuromuscular Home Page ofWU．url。遠(yuǎn)端型肌病是另一組以四肢遠(yuǎn)端肌肉無(wú)力和萎縮為主要表現(xiàn)的原發(fā)性肌肉疾病，根據(jù)病理及遺傳學(xué)特征，臨床上亦有多種亞型，如：Nonaka型、Miyoshi型、Welander型及眼咽型遠(yuǎn)端型肌病等，各型受累肌群和病情發(fā)展亦有較大的異質(zhì)性<'[1]>。Dysferlinopathy是由位于2p13的DYSF基因發(fā)生突變引起相應(yīng)的基因產(chǎn)物dysferl

3、in表達(dá)異常導(dǎo)致的肌營(yíng)養(yǎng)不良性疾病，臨床上可以表現(xiàn)為肢帶型肌營(yíng)養(yǎng)不良中的LGMD2B型，也可以表現(xiàn)為遠(yuǎn)端型肌病的Miyoshi型。本研究選取98例臨床病理診斷為肌營(yíng)養(yǎng)不良的病人，利用免疫學(xué)方法檢測(cè)病人肌肉中dysferlin的表達(dá)，進(jìn)一步探討dysferlinopathy的臨床和病理特點(diǎn)，借以與各型肌營(yíng)養(yǎng)不良和炎癥性肌病進(jìn)行鑒別，并對(duì)我國(guó)dysferlinopathy的發(fā)病特點(diǎn)進(jìn)行估計(jì)。 材料和方法： 選取山東大學(xué)齊魯

4、醫(yī)院神經(jīng)肌肉病研究室接診的98例臨床和病理診斷為肌營(yíng)養(yǎng)不良病人的肌肉標(biāo)本，其中Duchenne型肌營(yíng)養(yǎng)不良(DMD)22例，Beker型肌營(yíng)養(yǎng)不良(BMD)14例，肢帶型肌營(yíng)養(yǎng)不良(LGMD)56例，遠(yuǎn)端型肌營(yíng)養(yǎng)不良(MM)6例。另選病理報(bào)告為正常的肌肉標(biāo)本5例做為對(duì)照。經(jīng)液氮預(yù)冷的異戊烷中速凍的冰凍肌肉標(biāo)本制成4 μm冰凍切片，用抗dystrophin C-terminal、 dystrophin Rod、dystrophin N-t

5、erminal、α-sarcoglycan和dysferlin蛋白的五種單克隆抗體做免疫組織化學(xué)染色(IHC)，對(duì)dysferlin染色有缺陷病人的冰凍肌肉標(biāo)本，提取肌組織總蛋白行dysferlin蛋白印跡分析(westernblot，WB)。 結(jié)果： IHC與WB分析結(jié)果：在98例肌營(yíng)養(yǎng)不良病人肌肉組織中，經(jīng)IHC共發(fā)現(xiàn)有dystrophin染色缺陷43例，dysferlin染色缺陷16例，α-sarcoglycan

6、染色缺陷9例。其中dystrophin完全缺失20例，顯色不完整或減弱23例，dysferlin完全缺失5例，顯色不完整或減弱11例，α-sarcoglycan 完全缺失3例，顯色不完整或減弱6例。同時(shí)存在α-sarcoglycan和dystrophin缺陷5例，其中dystrophin缺失伴α-sarcoglycan減弱2例，α-sarcoglycan缺失伴dystrophin減弱1例，兩種蛋白染色均缺失1例，均減弱1例，dysfer

7、lin染色減弱同時(shí)伴有α-sarcoglycan缺陷1例(表格2，表格3)。對(duì)16例IHC顯示肌肉中dysferlin蛋白有缺陷病人的肌肉標(biāo)本，提取肌肉組織總蛋白并測(cè)定提取液蛋白濃度后，進(jìn)一步作WB分析，定量檢測(cè)dysferlin。結(jié)果發(fā)現(xiàn)有5例病人肌肉中dysferlin完全缺失，與IHC結(jié)果一致，3例在15﹪以下(表格5)，根據(jù)ENMC標(biāo)準(zhǔn)，這8例病人診斷為原發(fā)性Dysferlinopathy，以上8例病人IHC顯示α-sarcog

8、lycan與dystrophin染色正常。其余8例IHC顯示dysferlin有缺陷病人，WB結(jié)果在正常對(duì)照值的30﹪以上，認(rèn)為不屬于原發(fā)性dysferlinopathy。 結(jié)論： 1．本組8例dysferlinopathy，3例為近端型，去掉LGMD中免疫組化證實(shí)為BMD的12例病人，LGMD2B占全部LGMD的7﹪(3/44)，低于日本報(bào)告的18﹪<'[4]>。有MM型5例，占全部MM的83﹪(5/6)，提示我國(guó)的

9、 dysferlinopathy可能主要表現(xiàn)為遠(yuǎn)端型。 2．本研究在對(duì)dysferlin的免疫學(xué)檢測(cè)中運(yùn)用了IHC和WB兩種方法，以對(duì)IHC在dysferlinopathy診斷中的可靠性進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在IHC表現(xiàn)為dysferlin完全缺失的5例病人，WB結(jié)果亦為陰性，兩種方法具有高度的一致性。有部分病人在IHC結(jié)果為dysferlin表達(dá)減弱，而在WB結(jié)果中判斷為正常，鑒于WB結(jié)果的可靠性，我們認(rèn)為對(duì)于dysferlin

10、opathy的診斷，首先行IHC進(jìn)行篩檢，不能肯定的病例應(yīng)該進(jìn)一步行WB分析，以獲得可靠的診斷結(jié)果。 3．BMD病人病情相對(duì)較輕，各個(gè)家系之間臨床表現(xiàn)不盡相同，臨床上很多地方與LGMD相互重疊，肌肉病理表現(xiàn)為不同程度的肌營(yíng)養(yǎng)不良性改變，沒有特異性，散發(fā)病例與LGMD做出鑒別，往往需要進(jìn)一步的分子生物學(xué)檢查。用免疫組織化學(xué)或免疫熒光方法標(biāo)示肌纖維膜上的dysferlin和dystrophin，或者用WB方法證實(shí)骨骼肌組織dystr

11、ophin或dysferlin缺乏，是診斷與鑒別診斷兩種肌病的有效方法。IHC與WB也是dysferlinopathy與其他類型LGMD或遠(yuǎn)端型肌病相鑒別的主要手段。 4．Dysferlinopathy肌活檢的病理中炎性細(xì)胞浸潤(rùn)出現(xiàn)的頻率明顯較其他類型肌營(yíng)養(yǎng)不良高，本組8例dysferlinopathy中有3例出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，約占37.5﹪，炎性細(xì)胞主要分布在肌間質(zhì)及小血管周圍。由于多發(fā)性肌炎的起病年齡和臨床表現(xiàn)與本病非常相