杜興氏肌營養(yǎng)不良高危家族的產(chǎn)前基因檢測.pdf

1、目的： 杜興氏肌營養(yǎng)不良(DuehenneMuscularDystrophyDMD)是兒童最常見的X連鎖隱性遺傳致死性神經(jīng)肌肉系統(tǒng)疾病，約為活產(chǎn)男嬰的1/3500，進行性肌萎縮和肌無力，伴腓腸肌假性肥大是其典型的臨床特征，血清肌酸磷酸激酶(CPK)明顯升高，肌活檢顯示營養(yǎng)不良性肌病型，預后極差?；颊咂骄?～6歲發(fā)病，7～10歲左右即無法行走，多于20歲左右因心肺合并癥而死亡，嚴重影響了青少年男性的健康成長。本病目前尚無有效的治療

2、方法。DMD患者1/3是新生突變，2/3由遺傳而來，因此產(chǎn)前基因檢測是降低DMD患者出生及提供遺傳咨詢的重要措施，對提高人口質量具有十分重要的意義。 致病基因dystrophin基因定位于Xp21.1-21.3，全長約為2400kb，是目前已知的人類最大的基因之一，約占整個X染色體長度的1％及整個基因組長度的0.1％，其中79個外顯子編碼序列總長度僅為14kb，78個內(nèi)含子為該基因的大部分序列。內(nèi)含子區(qū)具有易脆性，致病基因的斷裂

3、點常非隨機地發(fā)生于內(nèi)含子區(qū)，有92％的缺失斷裂點發(fā)生在內(nèi)含子區(qū)域，內(nèi)含子序列在不同地域及民族中存在顯著性差異。Dystrophin基因突變類型以缺失最為常見，約占55～65％，主要分布5'端和中央兩個缺失熱點區(qū)；基因重復約占5～10％，其余的突變?yōu)辄c突變或微缺失，通常導致無義突變和移碼突變。 本研究在確定胎兒性別后，首先利用dystrophin基因內(nèi)常見18對外顯子引物的mPCR方法，檢測了缺失型DMD患者，并對其家族胎兒進行相

4、應缺失位點的檢測，然后應用dystrophin基因內(nèi)含子區(qū)的5對(CA)n引物，采用STR-PCR方法對非缺失型家族成員進行基因檢測及產(chǎn)前基因檢測。并且對mPCR引物進行優(yōu)化組合。本研究旨在建立一種簡便、可靠、臨床實用性較強的DMD高危家族的基因檢測及其產(chǎn)前基因檢測方法，為臨床：DMD高危家族孕婦開展了遺傳咨詢和產(chǎn)前基因診斷奠定了一定基礎。 材料與方法: 材料： 1.收集臨床病例：收集4例DMD患者均具有典型的臨

5、床表現(xiàn)，結合肌電圖、血清心肌酶譜及部分肌肉活檢而臨床確診； 2.樣本來源：抽取每名受檢者外周靜脈血5ml；在3例DMD高危家族的產(chǎn)前基因診斷中，于孕中期取羊水20ml，孕后期采臍血為樣本2ml，提取樣本DNA。 3.引物合成：1對性別決定基因(SYR)引物，dystrophin基因的18對外顯子引物和5對(CA)n引物均在NCBI上采用BLAST工具做比對，確定了所有引物準確性。 方法：先用SRY引物進行PCR擴

6、增判斷胎兒性別，而后采用mPCR方法檢測DMD患者：如檢測出有外顯子缺失的患者，再用單管PCR檢測胎兒相應位點，檢測男性胎兒是否缺失。對女性胎兒或未檢出外顯子缺失的男性胎兒，則采用STR-PCR擴增進行家系連鎖分析，以檢測胎兒的風險，進行DMD的產(chǎn)前基因診斷。 建立穩(wěn)定PCR反應體系： 1.SYR引物的PCR反應體系：總體積25ul，含有基因組DNA50ng，dNTP各200umol/L，引物各0.2umol/L，1xB

7、ueffr，Tarq酶用量2u。 2.mPCR反應體系：總體積15ul，含有基因組DNA100ng，dNTP各200umol/L，引物各0.2umol/L，1xBueffr，Tarq酶用量3u，引物分四組：A、B、C、D組。 3.STR-PCR反應體系：總體積25ul，含有基因組DNA50ng，dNTP各200umol/L,引物各0.2umol/L，1xBueffr，Tarq酶用量2U。 性別決定基因(SRY)引

8、物的PCR擴增產(chǎn)物在2％瓊脂糖凝膠電泳，18對外顯子引物的mPCR擴增產(chǎn)物經(jīng)3％瓊脂糖凝膠電泳，(CA)n引物PCR擴增產(chǎn)物在12％非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，均采用SYRBGreen熒光染料，自動凝膠成像系統(tǒng)上觀察結果。 結果: 胎兒性別決定基因檢測，共檢出4例胎兒，其中2例單胎和1例雙胎之甲胎為男性，1例雙胎之乙胎為女性，胎兒性別基因檢測結果均完全與胎兒羊水細胞的核型分析相符，且與胎兒出生后性別完全相同。采用mPCR結

9、合STR-PCR方法對4例DMD患者的高危家族進行產(chǎn)前基因突變類型檢測結果表明：4例DMD患者中有2例檢測出dystrophin基因外顯子的缺失，1例DMD患者為50，51二個外顯子缺失，另1例雙胎孕婦高危家族中DMD患者檢測出43外顯子缺失，同時對雙胎之男胎進行dystrophin基因43外顯子檢測，未發(fā)現(xiàn)男胎有43外顯子缺失。2例缺失型DMD患者的外顯子缺失位點主要集中在中央缺失熱區(qū)(44～52)內(nèi)，這與以往的研究較為一致。另2例D

10、MD患者的18對外顯子引物的mPCR未檢測到dystrophin基因外顯子的缺失，為非缺失型DMD患者。對3例DMD高危家族(包括2例非缺失型DMD高危家族和1例缺失型DMD雙胎高危家族)進行STR-PCR的dystrophin基因檢測發(fā)現(xiàn)：3例DMD高危家族的4例胎兒均繼承了與患者相同的母源致病單體型，除1例雙胎之女胎為風險基因攜帶者外，其余3例男胎均為DMD高危胎兒，3例患者母親均為雜合型，同時3例家族的其它成員均未檢測dystro