肢帶型肌營養(yǎng)不良的分子病理研究.pdf

1、目的:
　　 肢帶型肌營養(yǎng)不良(limb girdle muscular dystrophy,LGMD)是一組具有遺傳和臨床異質性的疾病,可為常染色體顯性(1型)、隱性(2型)遺傳,散發(fā)病例亦不少見,發(fā)病率約為1/10萬[1],由Walton和Nattrass[2]于1954年首先提出,用以區(qū)別DMD、面肩肱型等已知的肌營養(yǎng)不良。根據(jù)受累基因的不同LGMD1分為LGMD1A～LGMD1G七種類型,LGMD2又分為LGMD2A～L

2、GMD2L十二種類型(表格1,Neuromuscular Home Page of WU.url)。臨床上病變主要累及上、下肢帶肌,或以肢帶肌首先受累,逐漸出現(xiàn)全身肌肉的無力和萎縮。LGMD無特征性病理改變,各亞型之間單純以肌活體組織檢查病理結果難以鑒別[3]。突變基因和缺失蛋白分析是確診LGMD各亞型的必要手段。LGMD2A由常染色體15q15.1-q21.1上的CAPN-3基因突變導致其表達產(chǎn)物--骨骼肌特異性鈣激活蛋白酶-3(即c

3、alpain-3)活性異常所致,LGMD2B是由位于2p13的DYSF基因發(fā)生突變引起相應的基因產(chǎn)物dysferlin表達異常導致。本研究選取37例臨床病理論斷為肢帶型肌營養(yǎng)不良的病人,利用免疫學方法檢測病人肌肉中caveoiln-3、calpain-3、dysferlin、sarcoglycan的表達,進一步探討我國LGMD2A的臨床和病理特點,借以對各型肌營養(yǎng)不良進行鑒別。
　　 材料和方法:
　　 選取山東大學齊魯

4、醫(yī)院神經(jīng)肌肉病研究室接診的37例臨床和病理論斷為肢帶型肌營養(yǎng)不良病人的肌肉標本,其中肢帶型肌營養(yǎng)不良2B(LGMD2B)7例。另選病理報告為正常的肌肉標本5例作為對照。經(jīng)液氮預冷的異戊烷中速凍的冰凍肌肉標本制成5μm冰凍切片,用抗dystrophin C-terminal、dystrophinRod、dystrophin N-terminal、caveolin-3、、α-、β-、γ-、δ-sarcoglycan和dysferlin蛋白的

5、9種單克隆抗體做免疫組織化學染色(IHC),對7例LGMD2B型和排除LGMD2B型之后的30例分型未明的LGMD患者的冰凍肌肉標本,分別提取肌組織總蛋白行calpain-3和dysferlin蛋白印跡分析(westernblot,WB)。
　　 結果:
　　 IHC與WB分析結果:對其中7例肢帶型肌營養(yǎng)不良2B(LGMD2B)患者的冰凍組織,進行IHC發(fā)現(xiàn)患者dystrophin、caveolin-3和α、β-、γ-、

6、δ-sarcoglycan免疫組織化學染色均正常,提取肌肉組織總蛋白并測定提取液蛋白濃度后,進一步作WB分析,定量檢測calpain-3發(fā)現(xiàn)有2例calpain-3條帶表達呈不同程度的降低,可能為繼發(fā)的calpain-3減少。在排除LGMD2B型(7例)之后的30例分型未明的LGMD患者的冰凍組織中,經(jīng)IHC發(fā)現(xiàn)患者dystrophin、caveolin-3和α-、β-、γ-、δ-sarcoglycan免疫組織化學染色均正常,6例dys

7、ferlin染色減低。對30例分型未明的LGMD患者肌肉標本,提取肌肉組織總蛋白并測定提取液蛋白濃度后行WB分析,定量檢測calpain-3和dysferlin。有5例calpain-3蛋白條帶缺失或遺留痕跡,從而被確診為鈣蛋白酶肌病,即LGMD2A。以上5例病人IHC顯示dystrophin、caveolin-3和α-、β-、γ-、δ-sarcoglycan免疫組織化學染色均正常,2例dysferlin染色減低。其余病人的calpai

8、n-3條帶表達呈不同程度的降低,有10例calpain-3條帶表達在正常對照值的45％以上,8例病人calpain-3表達在正常對照值的20％-45％,5例病人<10％,calpain-3條帶明顯減弱但輪廓仍清晰,以上可能與繼發(fā)的calpain-3減少有關。2例calpain-3表達正常。6例dysferlin染色減低的患者肌肉標本W(wǎng)B結果在正常對照值的30％以上,認為不屬于原發(fā)性dysferlinopathy,可能為繼發(fā)性減少。

9、>　　 結論:
　　 1.本組5例LGMD2A,占全部LGMD的13.5％(5/37),低于文獻報道LGMD2A患者占總LGMD的約26％的平均水平[4]。
　　 2.本研究在對calpian-3的免疫學檢測中運用了WB方法,以補充calpian-3不能用于IHC的輔助診斷。結果發(fā)現(xiàn)5例病人calpian-3完全缺失。有2例病人在IHC觀察為dysferlin表達減弱,而在WB分析發(fā)現(xiàn)正常。鑒于WB結果的可靠性,我們認

10、為對于LGMD各型的診斷,首先行IHC進行排除性篩檢,進一步行WB分析,以獲得可靠的診斷結果。
　　 3.LGMD肌肉病理表現(xiàn)為不同程度的肌營養(yǎng)不良性改變,沒有特異性,往往需要進一步的分子生物學檢查。用免疫組織化學標示肌纖維膜上的dystrophin、caveolin-3、dysferlin和α-、β-、γ-、δ-sarcoglycan,對有染色缺陷的可疑病例和不能用于IHC的calpain-3蛋白用WB方法證實骨骼肌組織相關蛋