基于MLPA和外顯子組測序的杜氏-貝氏肌營養(yǎng)不良癥分子診斷新方法研究.pdf

1、杜氏/貝氏肌營養(yǎng)不良癥(Duchenne/Becker muscular dystrophy,DMD/BMD)可分為兩種類型,即DMD和BMD。DMD這是最常見致死性的X-連鎖隱性遺傳性肌病,以進行性肌萎縮無力伴小腿腓腸肌假性肥大為主要典型臨床特征。其發(fā)病率在活產(chǎn)男嬰為1/3500,多在3-5歲發(fā)病,在20歲左右死亡。BMD群體發(fā)病約為1/18000,臨床特征與DMD相似,但病情較輕。DMD基因定位在Xp21.2上,長2.4Mb,至少含

2、有79個外顯子,是目前已知最大的人類基因,包含有8個獨立的組織特異性啟動子。約75％DMD患者存在一個或多個外顯子大片段缺失或重復,剩余約25％被認為存在微小突變,包括點突變、小的插入缺失、復雜的微小重排等。在多數(shù)情況下,微小突變會導致翻譯的提前終止,形成功能不全的截短蛋白,從而引起疾病的發(fā)生。
　　 本研究的第一部分將多重連接依賴性探針擴增技術(multiplex ligation-dependentprobe amplifi

3、cation,MLPA)應用于DMD/BMD的分子診斷。對來自18個家庭臨床上懷疑為DMD的患者進行了MLPA分析,在6個患者的DMD基因中檢測出1至多個外顯子缺失(其中2例為新生突變),1例為外顯子重復突變。
　　 本研究的第二部分應用MLPA對兩個DMD高風險的孕婦進行了產(chǎn)前分子診斷,結果在其中一個胎兒的DMD基因中檢測到與先證者一樣的缺失突變,而另一個未測到與先證者一樣的突變。
　　 本研究的第三部分建立了一個檢測

4、DMD基因微小突變的分子診斷體系。對一具有典型DMD/BMD的臨床表現(xiàn),但MLPA未檢測到DMD基因外顯子缺失(或重復)的患者,利用第二代測序技術,對其外顯子組進行序列測定。在其DMD基因上發(fā)現(xiàn)一個突變:X_31950196_C/G,并通過Sanger測序法驗證了這一突變。該突變位于DMD基因的關鍵剪接供體位點上,可能會影響所在內(nèi)含子的識別和剪接。通過生物信息學工具對這突變進行預測,發(fā)現(xiàn)該突變點所在的5'端剪接供體位點失效了,并可能導致

5、剪接方式的改變。
　　 為進一步研究這一突變的致病機制,我們利用雜種小基因剪接試驗(hybridminigene splicing assay,HMSA),從細胞水平上分析病人和正常人DMD基因中該突變相關位置可變剪接的變化情況。將與該突變相關的側(cè)翼序列插入到pcDNATM3.1/Hygro(+)載體中,并瞬時轉(zhuǎn)染HeLa細胞,取其總RNA,采用RT-PCR技術分析可變剪接產(chǎn)物的表達情況。與正常對照相比,RT-PCR產(chǎn)物的序列測