基于MLPA和外顯子組測(cè)序的杜氏-貝氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥分子診斷新方法研究.pdf

1、杜氏/貝氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥(Duchenne/Becker muscular dystrophy,DMD/BMD)可分為兩種類型,即DMD和BMD。DMD這是最常見(jiàn)致死性的X-連鎖隱性遺傳性肌病,以進(jìn)行性肌萎縮無(wú)力伴小腿腓腸肌假性肥大為主要典型臨床特征。其發(fā)病率在活產(chǎn)男嬰為1/3500,多在3-5歲發(fā)病,在20歲左右死亡。BMD群體發(fā)病約為1/18000,臨床特征與DMD相似,但病情較輕。DMD基因定位在Xp21.2上,長(zhǎng)2.4Mb,至少含

2、有79個(gè)外顯子,是目前已知最大的人類基因,包含有8個(gè)獨(dú)立的組織特異性啟動(dòng)子。約75％DMD患者存在一個(gè)或多個(gè)外顯子大片段缺失或重復(fù),剩余約25％被認(rèn)為存在微小突變,包括點(diǎn)突變、小的插入缺失、復(fù)雜的微小重排等。在多數(shù)情況下,微小突變會(huì)導(dǎo)致翻譯的提前終止,形成功能不全的截短蛋白,從而引起疾病的發(fā)生。
　　 本研究的第一部分將多重連接依賴性探針擴(kuò)增技術(shù)(multiplex ligation-dependentprobe amplifi

3、cation,MLPA)應(yīng)用于DMD/BMD的分子診斷。對(duì)來(lái)自18個(gè)家庭臨床上懷疑為DMD的患者進(jìn)行了MLPA分析,在6個(gè)患者的DMD基因中檢測(cè)出1至多個(gè)外顯子缺失(其中2例為新生突變),1例為外顯子重復(fù)突變。
　　 本研究的第二部分應(yīng)用MLPA對(duì)兩個(gè)DMD高風(fēng)險(xiǎn)的孕婦進(jìn)行了產(chǎn)前分子診斷,結(jié)果在其中一個(gè)胎兒的DMD基因中檢測(cè)到與先證者一樣的缺失突變,而另一個(gè)未測(cè)到與先證者一樣的突變。
　　 本研究的第三部分建立了一個(gè)檢測(cè)

4、DMD基因微小突變的分子診斷體系。對(duì)一具有典型DMD/BMD的臨床表現(xiàn),但MLPA未檢測(cè)到DMD基因外顯子缺失(或重復(fù))的患者,利用第二代測(cè)序技術(shù),對(duì)其外顯子組進(jìn)行序列測(cè)定。在其DMD基因上發(fā)現(xiàn)一個(gè)突變:X_31950196_C/G,并通過(guò)Sanger測(cè)序法驗(yàn)證了這一突變。該突變位于DMD基因的關(guān)鍵剪接供體位點(diǎn)上,可能會(huì)影響所在內(nèi)含子的識(shí)別和剪接。通過(guò)生物信息學(xué)工具對(duì)這突變進(jìn)行預(yù)測(cè),發(fā)現(xiàn)該突變點(diǎn)所在的5'端剪接供體位點(diǎn)失效了,并可能導(dǎo)致

5、剪接方式的改變。
　　 為進(jìn)一步研究這一突變的致病機(jī)制,我們利用雜種小基因剪接試驗(yàn)(hybridminigene splicing assay,HMSA),從細(xì)胞水平上分析病人和正常人DMD基因中該突變相關(guān)位置可變剪接的變化情況。將與該突變相關(guān)的側(cè)翼序列插入到pcDNATM3.1/Hygro(+)載體中,并瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞,取其總RNA,采用RT-PCR技術(shù)分析可變剪接產(chǎn)物的表達(dá)情況。與正常對(duì)照相比,RT-PCR產(chǎn)物的序列測(cè)