面肩肱型肌營養(yǎng)不良癥（FSHD）實時熒光定量PCR診斷方法的研究.pdf

1、研究目的： 1.建立簡便、快速診斷FSHD的方法。采用實時熒光定量PCR技術(shù)對FSHD進行基因診斷，解決由于10q26和4q35的高度同源、易位及探針的結(jié)合部位缺失等造成印跡雜交基因診斷欠準(zhǔn)確的問題； 2.通過檢測FSHD患者剩余的D424拷貝數(shù)，研究其與臨床表現(xiàn)的關(guān)系。 研究對象與方法： 1.研究對象 共115例，分為以下4組(1) 印跡雜交基因診斷的FSHD患者：16例(曾在本課題組做過印跡雜

2、交基因診斷，故.EcoR Ⅰ片段大小已知)(2)正常對照人群：78例(3)新的FSHD患者(符合臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)，EcoR Ⅰ片段大小未知)：16例(4)FSHD高危人群：5例 2.研究方法 用常規(guī)酚/氯仿抽提法抽提基因組DNA，用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ酶切基因組DNA，再進行瓊脂糖凝膠電泳，然后切膠回收38kb以下的基因組片段，所得的DNA作為模板進行實時熒光定量PCR檢測，根據(jù)熒光曲線與陽性對照的對比判斷基因診斷的結(jié)果為

3、陰性/陽性。 結(jié)果： 1.實驗方法的研究：FQ-PCR的FSHD基因診斷標(biāo)準(zhǔn)的建立實驗中，發(fā)現(xiàn)大部分標(biāo)本的熒光曲線結(jié)果與臨床表現(xiàn)相符(FSHD患者的熒光曲線上抬明顯，正常對照的熒光曲線低平)，但亦存在相當(dāng)部分標(biāo)本的熒光曲線結(jié)果不理想，故進行了一系列的方法研究。發(fā)現(xiàn)通過改變退火溫度、退火延伸時間、鎂離子濃度、RNase H酶的用量都不能增加FSHD患者與正常對照的熒光曲線差異，最后通過降低RNase H酶的活性而提高了實驗

4、的特異性。從而確定了本實驗基因診斷的標(biāo)準(zhǔn)。 2.16例已知EcoR Ⅰ片段大小的FQ-PCR對比分析16例已知EcoR Ⅰ片段大小的FSHD患者中，EcoR Ⅰ多態(tài)片段短于35kb的患者有14例，有2例的EcoR Ⅰ多態(tài)片段大于48.5kb。大于48.5kb的2例FQ-PCR檢測為陰性，短于35kb的14例中，13例為陽性，33.5kb的1例為陰性。 3.78例正常對照人群的FQ-PCR分析：陽性3例，陰性75例。

5、 4.16例未知EcoR Ⅰ片段大小(新的FSHD患者)的FQ-PCR分析：陽性15例，陰性1例。 5.5例高危人群的FQ.PCR分析：陽性3例，陰性2例。 6.統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果 用統(tǒng)計學(xué)方法分析了FQ-PCR方法和傳統(tǒng)方法的關(guān)聯(lián)性及一致性的檢驗，F(xiàn)Q-PCR方法和臨床診斷的關(guān)聯(lián)性、一致性及FQ-PCR方法用于臨床的評價指標(biāo)、ROC曲線。結(jié)果均顯示有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，F(xiàn)Q-PCR方法和傳統(tǒng)方法可以互相代

6、替，用于臨床也有較高的診斷價值，值得進一步推廣。 結(jié)論： 1.創(chuàng)建了一種新的面肩肱型肌營養(yǎng)不良癥(FSHD)基因診斷方法，其效價與傳統(tǒng)方法相近，能較好解決傳統(tǒng)方法的費時費力、具有放射性污染等問題。 2.應(yīng)用這種實時熒光定量PCR方法，可以檢查出發(fā)生了4q35與10q26易位、探針結(jié)合部位缺失等情況的患者，進一步提高了面肩肱型肌營養(yǎng)不良癥(FSHD)基因診斷的準(zhǔn)確性。 3.該法簡便易行，可為臨床確診、遺傳咨